三七香叶基香叶基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

基于三七转录组测序结果,选择萜类代谢骨架上香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(GGPPS),结合RACE技术,克隆得到全长1 203 bp的cDNA序列,最长开放阅读框为1 035 bp,命名为PnGGPPS,GeneBank登录号为KM486564,PnGGPPS基因全长2 370 bp,包含1个内含子和2个外显子,该基因编码344个氨基酸,与蓖麻Ricinus communis、丹参Salvia miltiorrhiza等植物GGPPS的同源性达到73%以上,具有富天冬氨酸区等多个结构域,属于类异戊二烯合成酶超家族。实时荧光定量PCR结果显示,PnGGPPS在一至三年生三七的根、茎、叶和三年生的花等不同器官组织中均有表达,但以三年生叶中具有显著水平的高表达量,暗示其既具有调节三七生长发育的基本功能,也与三七叶绿素和类胡萝卜素的合成、叶绿体的发育、阴生适应性,以及品质的形成有关。     

三七病程相关蛋白PR10-1基因克隆及功能初步分析

采用同源克隆法和RACE技术相结合,对三七根部蛋白质组差异进行研究,鉴定PR10-1蛋白相应的基因全长c DNA,初步分析该基因在三七中的功能。测序结果显示该基因序列全长863 bp,包含1个序列长465 bp编码155个氨基酸的开放阅读框,命名为Pn PR10-1,Gen Bank登录号KJ741402。氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现,Pn PR10-1与人参的PR10-1蛋白同源性最高,含有Bet-v-I家族等多个保守结构域。实时荧光定量PCR分析显示,Pn PR10-1在1~3年生三七各组织中均有本底表达,暗示其参与生长发育、代谢调控等生物学过程;Pn PR10-1在根部受根腐病原菌(Fusarium oxysporum)胁迫上调表达,推测Pn PR10-1基因可能参与抗三七根腐病等广谱抗病防御反应。     

HPLC测定假蒟中的α-细辛脑及其含量的动态积累

目的 采用HPLC法测定假蒟中α-细辛脑的含量,观察其动态积累变化.方法 色谱柱为phenomenex ODS2柱(250mm×4.60 mm,5μm),流动相为乙腈-0.05％磷酸溶液(49∶51),流速1.0 mL· min-1,检测波长313 nm,柱温30℃.结果 α-细辛脑0.0975 ～ 1.9500 μg与峰面积的线性关系良好(r=0.9998),平均回收率为101.59％(RSD=2.10％,n=6).结论 所用方法简便、快捷、重复性好,可作为假蒟药材中α-细辛脑的含量测定方法.     

小花山小橘叶及茎化学成分初步研究

目的 采用系统预试法对小花山小橘叶及茎可能的化学成分进行预实验,初步探索小花山小橘叶及茎的化学成分.方法 采用试管反应法、纸反应法,对小花山小橘叶及茎水、95％乙醇、石油醚提取物进行研究,通过多种指示剂和显色剂的颜色反应或沉淀反应,对小花山小橘叶及茎可能含有的化学成分进行初步研究.结果 小花山小橘叶及茎可能含有氨基酸、多肽、蛋白质、糖、多糖、苷类、酚类、鞣质、有机酸、黄酮、内酯、香豆素、甾体、三萜类、挥发油等化学成分.结论 初步确定小花山小橘叶及茎含有多种化学成分,为小花山小橘叶及茎的进一步开发利用提供了实验基础.     

三七GGPPS基因CDS序列克隆及原核表达

目的为研究GGPPS基因在三七中的功能,从三七中克隆GGPPS基因CDS序列,并进行原核表达。方法以3年生三七叶组织为材料,依据Genbank中已报道的GGPPS基因序列设计引物,利用RT-PCR技术,克隆得到编码区序列;克隆片段连接到p ET-30α(+)表达载体,转入大肠杆菌BL21后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果三七GGPPS基因CDS序列全长1 032 bp,编码343个氨基酸。SDS-PAGE结果表明,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白大小在29 000~44 000,且表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。结论成功克隆了三七GGPPS基因CDS序列,建立了稳定的原核表达体系,为进一步研究其在三七中的生物学功能奠定了基础。