基因组导向的丝状真菌沉默生物合成基因簇激活策略D

真菌是药物先导结构的重要来源,得益于基因组测序技术的飞速发展,生物信息学分析发现真菌中存在大量次级代谢产物基因簇。而这些基因簇在常规实验室培养条件下往往不表达代谢产物,被称之为“沉默”基因。同时,随着天然产物分离技术在日益进步,结构新颖的天然产物发现的几率却在减少。因此如何借助基因组数据分析并激活沉默的基因簇,“解密”天然产物的宝藏,挖掘真菌潜在的代谢潜能成为研究热点。本文主要介绍了基因组导向的丝状真菌沉默生物合成基因簇的激活策略。     

通过阻断GntR家族调控基因ygrA挖掘海洋链霉菌Streptomyces sp. OUC6819中抗MDR菌活性次级代谢产物

激活南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp.OUC6819菌株中不表达或表达量低的隐性生物合成基因簇,挖掘具有优良多重耐药菌（MDR）抗菌活性的次级代谢产物。方法 通过生物信息学分析推测Streptomyces sp.OUC6819基因组中可能的GntR家族调控子,采用PCR-targeting策略敲除其中的ygrA基因,HPLC分析突变株和野生株的发酵产物的差异,并比较粗提物对5株MDR菌抑制活性。结果 HPLC分析结果表明与野生株相比,突变株中化合物1和化合物2产量分别产量提高了9倍和7倍;突变株发酵液粗提物对其中3株MDR菌抑制活性较野生株明显提高。结论 通过阻断GntR家族调控子ygrA激活了Streptomyces sp.OUC6819菌株中具有抗MDR菌活性次级代谢产物合成基因簇的表达,为从中发掘新的抗MDR菌抗生素奠定了必要基础;同时,将为其他海洋链霉菌中隐性基因簇的激活提供重要参考。     

红树林放线菌Streptomyces sp.CHQ-61产生的胞外多糖结构及自由基清除活性

目的 探究红树林放线菌Streptomyces sp.CHQ-61产生的胞外多糖的结构及自由基清除活性。方法 利用乙醇沉淀法、阴离子交换层析柱和凝胶层析柱对菌株发酵产物中的胞外多糖进行分离纯化,运用核磁共振、气质联用色谱、红外光谱、高效凝胶渗透色谱和柱前衍生高效液相色谱分析鉴定多糖的结构特征,采用DPPH、超氧阴离子和羟基自由基清除率评价胞外多糖的抗氧化活性。结果 从红树林放线菌Streptomyces sp.CHQ-61发酵产物中分离得到多糖XH-1,其分子量为8.9 kDa,丙酮酸含量为4.0 %,主要由半乳糖和氨基葡萄糖组成,糖链主要含有(1→6)Galp,还有少量的(1→3)GlcNp、(1→4,6)Galp、(1→3,6)GlcNp、末端Galp和GlcNp,XH-1具有一定的体外自由基清除活性,其清除DPPH、超氧阴离子和羟基自由基的EC50分别为0.5、0.8和3.0 mg/mL。结论 本文首次报道了红树林根泥放线菌Streptomyces sp.CHQ-61产生的胞外多糖XH-1为1种含有丙酮酸的半乳糖和氨基葡萄糖组成的结构新颖的胞外多糖,其具有较强的体外自由基清除活性。     

多效调控基因wblAyo对海洋链霉菌Streptomyces youssoufiensis OUC6819次级代谢产物及形态分化的影响

目的 激活南海红树林来源的链霉菌Streptomyces youssoufiensis OUC6819中不表达或表达水平低的隐性基因簇,进一步挖掘新颖的次级代谢产物。方法 采用PCR-targeting策略敲除WhiB-like（Wbl）家族的wblAyo基因,通过HPLC分析野生株和突变株发酵产物的差异,检测发酵液粗提物和C18开放柱层析组分对5种多重耐药（MDR）菌（Staphylococcus aureus CCARM 3090, Salmonella typhimurium CCARM 8250, Escherichia coli CCARM 1009, Enterococcus faecium CCARM 5203,Enterococcus faecalis CCARM 5172）的抑制活性,通过固体平板实验和光学显微镜观察链霉菌形态分化的改变。结果 得到了正确的ΔwblAyo阻断突变株,HPLC分析结果表明：与野生株相比,突变株中化合物峰1和2分别提高了15.6和9.3倍;突变株发酵液粗提物和组分11对E. faecium CCARM 5203,E. faecalis CCARM 5172和S. aureus CCARM 3090的抗菌活性与野生株相比明显提高,而且突变株丧失了产生孢子的能力。结论 wblAyo参与了S. youssoufiensis OUC6819的次级代谢和形态分化过程。wblAyo的阻断激活了S. youssoufiensis OUC6819中抗MDR菌活性次级代谢产物的产生,为继续挖掘活性化合物提供了必要基础,还为其他海洋链霉菌中隐性基因簇的激活提供了参考。     

南极海绵共附生真菌Talaromyces sp. HDN1820200次级代谢产物研究

目的对南极海绵共附生来源真菌Talaromyces sp.HDN1820200的次级代谢产物进行研究。方法对菌株发酵液粗提物利用柱层析(VLC,ODS)、凝胶分子筛(LH-20)以及半制备高效液相(MPLC)等方法进行次级代谢产物的分离纯化;利用现代波谱学方法(核磁共振NMR、圆二色谱ECD、红外光谱IR等)对化合物进行结构鉴定。结果分离鉴定了8个单体化合物:(2E,4E,6E)-4-methyldodeca-2,4,6-trienoic acid(1)、(2E,4Z,6E)-4-methyldodeca-2,4,6-trienoic acid(2)、Herbaridine B(3)、Kasanosin C(4)、Citrinolactone A(5)、Citreorosein(6)、1,5,8-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)anthracene-9,10-dione(7)和Rugulosin B(8)。结论从南极海绵来源真菌Talaromyces sp.HDN1820200中分离得到了化合物1~8,其中化合物1和2为新化合物,属于脂肪酸类化合物,无明显细胞毒活性。     

海洋放线菌分离及菌株Streptomyces sp.LXF-80的次级代谢产物的研究

目的对黄海和渤海的海泥样品进行海洋放线菌分离,并选出1株次级代谢产物较丰富的菌株Streptomyces sp.LXF-80进行研究。方法采用稀释涂布平板法进行海洋放线菌的分离,应用溶剂萃取,TLC分析,柱色谱层析及制备HPLC等方法对菌株LXF-80的发酵产物进行研究,通过理化性质及波谱学手段并参阅文献进行化学结构鉴定,采用SRB法及MTT法评价化合物的抗肿瘤活性。结果从海泥样品中分离到海洋放线菌142株,从菌株LXF-80发酵提取物中分离到化合物5个,其中聚酮类化合物1个,环二肽类化合物4个,经结构鉴定分别为Enterocin(1)、Cyclo(L-Trp-L-Lue)(2)、Cyclo-...     

红树林植物内生真菌Stachybotrys chartarum HDN16-358次级代谢产物研究

目的 对红树林植物内生真菌Stachybotrys chartarum（HDN16-358）进行次级代谢产物的研究。方法 利用薄层色谱层析（TLC）,反相ODS,Sephadex LH-20、半制备型HPLC等色谱学方法对菌株发酵粗提物进行分离纯化;利用NMR、MS、UV等波谱学技术手段,解析确定化合物的结构,并对新天然产物1进行了细胞毒活性筛选。结果 分离鉴定了5个单体化合物：(2S)-5-Hydroxy-2,7-dimethyl-2-(4,8-dimethyl-3E,7-nonadienyl)-2H-chromene-6-carbaldehyde (1),BR-011 (2),LL-Z 1272β (3) and stachybotrylactone (4),5-Methylbenzene-1,3-diol (5)。结论 红树林来源真菌是重要活性物质来源和生物资源。从红树林植物内生真菌Stachybotrys chartarum中分离得化合物1-5,化合物1首次从自然界中分离得到,且具有中等细胞毒活性。     

百草枯农药对小鼠血液中血细胞参数的影响

目的观察百草枯农药急性经口染毒对小鼠的毒性反应和血细胞参数的影响。方法 SPF级昆明种小鼠60只,随机分为百草枯农药染毒6 h、1 d、3 d和7 d和对照组共5组,百草枯农药60 mg/kg.BW一次经口灌胃染毒,对照组使用蒸馏水灌胃。观察动物的体重和死亡数等中毒表现,并测定血液中14项血细胞参数。结果百草枯农药染毒动物体重下降、活动减少、毛发蓬松、呼吸困难,死亡率为16.67%。百草枯农药染毒3 d组与对照组比较,雌鼠的淋巴细胞百分比(LYMPH%)降低(F=2.96,P0.05),单核细胞百分比(MONO%)增高(F=3.83,P0.05),差异有统计学意义(P0.05)。结论百草枯农药60 mg/kg经口染毒对小鼠产生明显的毒性反应症状,染毒后3 d血液中淋巴细胞百分比降低,单核细胞百分比增高。     

美替拉酮对放线菌Streptomyces sp. LXF-80代谢途径的影响

摘 要：目的 渤海海泥来源放线菌Streptomyces sp. LXF-80可以生产罕见的包含α－吡喃酮的三环骈合聚酮化合物肠道菌素（Enterocin）。美替拉酮是一种细胞色素P450氧化酶的抑制剂,本实验试图利用美替拉酮影响肠道菌素的生合成过程,表达获得新的聚酮类化合物。方法 向LXF-80的发酵培养基中添加酶抑制剂,结合HPLC分析确定最优条件,并进行大规模发酵和目标产物的分离。结果 从添加美替拉酮的LXF-80发酵提取物中共分离获得3个化合物,包括Enterocin（1）、5-deoxyenterocin（2）以及3-epi-5-deoxyenterocin（3）。结论 实验结果证明美替拉酮的添加,影响了菌株聚酮类化合物的生合成过程,得到两个肠道菌素的形成过程中的中间体化合物2和3。