靶向人血管紧张素原小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：RNA干扰技术通过将具有一定结构特点、长19~25 bp的双链小干扰RNA导入哺乳动物细胞,特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子,导致目的基因表达抑制。 目的：拟构建针对人血管紧张素原mRNA的小干扰RNA表达载体,从而抑制肾素基因在脂肪细胞的表达。 方法：从NCBI中查找人血管紧张素原基因全长mRNA序列(NM000029),利用GeneScript公司提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,自行设计靶向血管紧张素原的两条shRNA的DNA模板单链,合成靶向血管紧张素原基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的psiRNAT-U6.1/Neo质粒连接,在TOP10菌株中扩增,并测序鉴定。 结果与结论：将含有血管紧张素原-mRNA目标序列19 bp的双链DNA插入片段,连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒形成重组质粒。EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,空载体得到351 bp小片段,而人重组质粒得到397 bp小片段,与预期相符。EcoRⅠ和Kpn Ⅰ双酶切后,空载体得到1条345 bp小片段,而人重组载体没有得到小片段条带,与预期相符。测序结果表明psiRNAT-U6.1/Neo质粒已经插入人脂肪细胞的干扰合成片段,无碱基突变,成功构建了靶向血管紧张素原-小干扰RNA表达载体。     

CpG基序对HBV DNA疫苗诱导小鼠产生抗-HBs的影响

为研究CpG基序克隆入质粒载体后对乙型肝炎病毒 (HBV)DNA疫苗诱导小鼠产生抗 HBs的影响。构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX CpGS2 S ,其中通过PCR克隆了若干个CpG基序到质粒载体中 ,按不同剂量一次性肌内注射免疫小鼠 ,ELISA法检测小鼠血清抗 HBs。结果发现与不含CpG基序的对照组相比较 ,克隆了CpG基序的实验组一次性免疫BALB/c小鼠后诱导产生的抗体效价比对照组免疫效果好 ,但两者差异不显著     

HPLC法测定贯叶连翘药材及提取物中金丝桃素的含量

目的:建立贯叶连翘药材及提取物中金丝桃素的含量测定方法。方法:样品经甲醇超声波提取,采用Krom asil C18柱(4.6 mm×200 mm,5μm)分离测定;甲醇-0.006 mol/L磷酸氢二钠(87.5∶12.5,v/v,用磷酸调pH至6.5)为流动相;检测波长590 nm;流速1.0 m l/m in。结果:金丝桃素在0.0095μg~0.285μg范围内呈良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为101.2%,RSD为1.1%。结论:本方法快捷、简便,结果准确、可靠,可作为贯叶连翘药材及提取物中有效成分的质量控制方法。     

光源对金丝桃素光动力体外抗肿瘤作用的影响

目的 研究金丝桃素和贯叶金丝桃中金丝桃素提取物对人肝癌细胞株HepG2的体外杀伤效应及光源对其抗肿瘤作用的影响.方法 分析金丝桃素及金丝桃素提取物的吸收光谱,用不同波长的光源激发进行体外细胞毒试验,采用显微镜观察、MTT法分析和DNA电泳等方法评价金丝桃素及金丝桃素提取物的抗肿瘤效果.结果 590 nm的黄光激发金丝桃素和金丝桃素提取物对HepG2细胞有显著的体外杀伤效应,生长抑制率分别为51.5%、83.1%,其他波长光源的作用不显著.结论 金丝桃素的光动活性依赖于光源的波长,受适当光源激发的金丝桃素及金丝桃素提取物能显著抑制HepG2细胞的生长,显示金丝桃素有良好的光动力治疗肝癌的开发前景.     

贯叶金丝桃中金丝桃素提取物对人肺癌细胞A549的体外杀伤效应

金丝桃素(Hypericin,HY),化学名4,4′,5,5′,7,7′-六羟基-2,2′-二甲基-中位-萘骈二蒽酮,是贯叶金丝桃(HypericumperforatumL.)中一种具有高度生物活性的物质。目前己证实金丝桃素具有抗抑郁、抗病毒、抗炎症及抗肿瘤等多种生物学活性[1]。近年来,金丝桃素在肿瘤的光动力治疗(     

用微型包囊法研制新型高效微生态活菌制剂

采用流化床技术与喷嘴结合的微型包囊法,将3种双歧杆菌、高效活菌保护剂和双歧促生因子一起作为核心物质,包封于无毒囊材中制成耐酸肠溶微囊(或微球).微囊在人工模拟胃液(pH 1.5～2.0)中处理4 h,其中的双歧杆菌活菌数仍保持在44%以上;在人工肠液中处理12 min,微囊全部崩解释放出活性菌,在37℃下保存3个月(相当于常温下1年以上),其中的活菌数仍大于109个/g.有效地解决了胃酸、消化酶和抗生素等对活性双歧杆菌的灭活和产品常温保存期短的问题.     

靶向人血管紧张素原小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景:RNA干扰技术通过将具有一定结构特点、长19～25 bp的双链小干扰RNA导入哺乳动物细胞,特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子,导致目的基因表达抑制.目的:拟构建针对人血管紧张素原mRNA的小干扰RNA表达载体,从而抑制肾素基因在脂肪细胞的表达.方法:从NCBI中查找人血管紧张素原基因全长mRNA序列(NM000029),利用GeneScript公司提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,自行设计靶向血管紧张素原的两条shRNA的DNA模板单链,合成靶向血管紧张素原基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的psiRNAT-U6.1/Neo质粒连接,在TOP10菌株中扩增,并测序鉴定.结果与结论:将含有血管紧张素原-mRNA目标序列19 bp的双链DNA插入片段,连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒形成重组质粒.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,空载体得到351 bp小片段,而人重组质粒得到397 bp小片段,与预期相符.EcoRI和Kpv Ⅰ双酶切后,空载体得到1条345 bp小片段,而人重组载体没有得到小片段条带,与预期相符.测序结果表明psiRNAT-U6.1/Neo质粒已经插入人脂肪细胞的干扰合成片段,无碱基突变,成功构建了靶向血管紧张素原-小干扰RNA表达载体.     

免疫磁分离-荧光PCR应用在肉类单增李斯特氏菌的检测

目的建立适用于肉类产品中单核增生李斯特氏菌的荧光PCR检测方法。方法根据单增李斯特氏菌溶血素基因hlyA,设计合成引物和荧光探针,结合免疫磁珠筛选,选择简便的DNA提取方法,建立适用于检测肉类制品中单增李斯特氏菌的荧光PCR方法。对该方法进行特异性、灵敏度及模拟样品检测效果的研究。结果对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株,及混合菌液的检测,结果显示该方法具有良好的特异性。对染菌模拟样本的检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27h。结论免疫磁分离荧光PCR方法为快速、简便和准确检测肉类制品中单增李斯氏菌提供了一个新的途径。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

纳豆激酶基因重组质粒在大肠杆菌与毕赤酵母中的稳定性

利用PCR方法以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因片段,分别克隆到原核表达载体pBV220与真核表达截体pPICZaA上,转化大肠杆菌HB101与毕赤酵母GS115,筛选重组子,通过限制性内切酶,PCR分析及序列测定,测定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,对重组大肠杆菌与毕赤酵母中外源基因的稳定性进行研究比较,结果表明外源基因的插入对宿主菌的生长没有太大影响,重组质粒在E.coli HB101中具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差,而外源基因在毕赤酵母（GS115中很稳定。