慢性再生障碍性贫血患者肿瘤坏死因子的研究

慢性再生障碍性贫血患者肿瘤坏死因子的研究赵青李树浓梁晓燕国内外一些学者都是从总体上对再生障碍性贫血（再障）患者的血浆肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）水平及其单个核细胞ＴＮＦ的诱生水平的检测对再障与ＴＮＦ的关系进行研究，且各家报道的结果也不一致。为进一步探讨再障...     

血小板生成素thrombopoietin对神经保护作用的体外研究

目的体外研究血小板生成素（TPO,一种调控巨核细胞和血小板生成的因子）,对神经祖细胞C17.2的保护作用。方法建立无血清条件下C17.2细胞凋亡的模型,用TPO不同浓度处理C17.2细胞,利用MTT、Western blotting、流式细胞技术等方法检测TPO对C17.2细胞的保护作用。结果不同浓度的TPO（0、1、10、50、100、200ng/ml）都能促进C17.2细胞增殖,并且具有剂量依赖性。TPO使磷酸化AKT水平增加,促进神经祖细胞增殖,LY294002可以阻止细胞的增殖。用流式细胞仪方法检测表达Annexin V的细胞减少。结论体外研究显示TPO通过激活PI3K/AKT信号通路,对神经祖细胞C17.2起保护作用,这一发现为临床上神经损伤的治疗提供了新的思路。     

骨髓间质干细胞抑制大鼠肝纤维化形成的可能性受体肝内干细胞存活时间、肝星状细胞活化程度及生存分析的7周观察

目的观察在体外培养条件下,具有强大的增殖和分化为肝细胞能力的骨髓间质干细胞输注治疗肝纤维化模型大鼠对其肝纤维化形成的影响及肝功能和生存分析,并对治疗组、空白对照组和病理对照组7周内的相关情况予以对照比较.方法实验于2003-08/2004-10在中山大学基础医学院病理学于病理生理实验室完成.①动物分组选用雄性6周龄Wistar大鼠5只为供体,供分离骨髓间质干细胞;雌性6周龄Wistar大鼠60只,其中50只被造成肝纤维化模型,在首次用二甲基亚硝胺处理后的第10天,将造模大鼠随机分为2组骨髓间质干细胞治疗组10只(为受体),于治疗39 d后结束实验,取材分析病理对照组40只.另10只作为空白对照组(仅静脉注射生理盐水).②肝纤维化模型制作在实验的当天,给予10g/L二甲基亚硝胺溶液(生理盐水配置)1 mL/kg,腹腔注射,每周连续3次,共6周.③骨髓间质干细胞治疗组每只大鼠输注3×106个骨髓间质干细胞;病理对照组使用等体积生理盐水代替骨髓间质干细胞.④动物的一般生活状态每天观察饮食、活动、二便、体质量、皮毛、呼吸情况等.⑤肝脏的组织细胞形态结构将肝组织以苏木精-伊红染色后观察.⑥肝星形细胞及其活化程度检测前者检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白含量,用免疫组织化学染色法,后者以德国IBAS2.5图像分析软件半定量分析.⑦肝脏胶原分布的相对含量检测采用Masson三色染色法,从而反映肝纤维化程度.⑧肝脏羟脯氨酸含量测定采用氯胺T法.⑨血清总胆红素和谷丙转氨酶水平检测采用全自动生化分析仪.⑩血清层粘蛋白和透明质酸水平测定采用放射免疫法.11雄性大鼠骨髓间质干细胞在雌性大鼠肝内的Y染色体性别决定区基因的表达检测采用聚合酶链式反应.12统计学分析两组样本均数比较采用t检验;多组样本均数比较采用方差分析,两两比较采用q检验;生存分析采用K,plan-Meier法.结果雌性大鼠60只进入结果分析.①实验动物生存状况造模6周后,骨髓间质干细胞治疗组生存率为80%,而病理对照组生存率为10%,空白对照组生存率为100%,说明骨髓间质干细胞治疗可能通过阻止肝纤维化发展,从改而善大鼠的生存率.②肝脏组织学显示,骨髓间质干细胞治疗组的肝脏结构明显改善,炎症减轻、假小叶结构减少或消散.相反,病理对照组出现广泛的肝脏结构重塑,包括增厚的纤维间隔形成和明显的桥接坏死.半定量分析胶原染色,骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(8.12±1.98,15.71±2.13,t=6.11,P＜0.05).③肝脏星状细胞活化的标志α-平滑肌激动蛋白的阳性表达空白对照组仅见血管壁有少量α-平滑肌激动蛋白的阳性表达,而病理对照组和骨髓间质干细胞治疗组可见在纤维间隔、肝窦和汇管区内明显表达.半定量分析α-平滑肌激动蛋白的阳性染色,骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(11.06±2.03,18.50±3.87,t=4.47,P＜0.05).④Y染色体性别决定区基因的表达经雄性Wistar大鼠(供体)骨髓间质干细胞治疗39 d的雌性大鼠,肝脏DNA经聚合酶链式反应检测结果显示,Y染色体性别决定区基因的表达阳性,而空白对照组和病理对照组则无此阳性信号.说明骨髓间质干细胞移植后,能够在受体肝内存活5周以上.⑤反映肝脏纤维化程度的肝脏羟脯氨酸含量及血清层黏蛋白和透明质酸水平骨髓间质干细胞治疗组明显高于空白对照组(P＜0 05)但明显低于病理对照组(P＜0.05),说明骨髓间质干细胞治疗后能够减少肝脏胶原蛋白的含量,从而减少肝纤维化的形成,使肝纤维化得到控制.⑥反映肝功能的血清总胆红素、谷丙转氨酶水平骨髓间质干细胞治疗组明显低于病理对照组(P＜0.05),接近空白对照组.说明了骨髓间质干细胞治疗有助于改善肝功能状态.结论①二甲基亚硝胺能成功诱导大鼠肝纤维化模型的建立.②骨髓间质干细胞可改善肝纤维化大鼠的生存状况和肝功能.③骨髓间质干细胞能够减少肝脏胶原蛋白的产生,抑制肝纤维化形成.④肝纤维化发生发展过程中活化态的肝星状细胞数量减少可能是骨髓间质干细胞抑制肝纤维化形成的原因之一.⑤雌性大鼠肝脏内存在雄性供体Y染色体性别决定区基因的信号说明骨髓间质干细胞能够在受体肝内存活5周以上.     

亚致死量~(60)Coγ射线照射后小鼠骨髓造血细胞程序性死亡特性研究

照射可引起免疫器官萎缩和免疫功能抑制,研究发现其机制为照射后胸腺细胞发生了程序性死亡(programmed cell death,PCD)。骨髓组织对射线也很敏感,造血细胞辐射损伤机制目前尚不清楚。本实验研究从超微结构、DNA裂解、PI染色FACS分析等方面,动态地观察了~(60)Coγ射线照射后小鼠骨髓细胞的变化。实验采用成年SPFBALB/c小鼠。2.0,4.0,6.0Gy照射后6小时透射电镜显示细胞出现空泡,有不同程度的固缩;第3,6,9,12,24,36小时测得DNA裂解百分率较对照组增高;27000×g上清DNA琼脂糖凝胶电泳有大量小分子片段,分子量约为180bp的整倍数,呈典型梯状图谱;FACS分析也表明PCD细胞百分率于第3小时增高,渐增强,24小时达高峰。实验表明,亚致死量照射可引起骨髓有核细胞PCD。由于造血干细胞在形态上难以辨认,故射线有无引起造血干细胞PCD尚不能肯定,有待进一步研究。     

人脐血有核细胞在缺氧缺血新生大鼠脑内的生存及其抗原表达

目的:观察人脐血有核细胞在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内生存和抗原表达。方法:实验于2002-09/2004-03在深圳宝安血站干细胞研究实验室内完成。①实验中采用羟乙基淀粉沉淀法分离脐血有个核细胞。②5窝F344新生1d龄大鼠共64只,同窝随机分为3组:正常组:不干预。模型组:结扎左颈动脉,吸入体积分数为0.08的低氧3h制成缺氧缺血性脑病模型。人脐血有核细胞组:造模后24h定位注射人脐血有核细胞(1.0～2.0)×106。③Morris水迷宫试验评估移植后第42天大鼠学习和记忆能力;第10周麻醉状态下处死实验鼠,制作病理切片,苏木精-伊红染色和间接免疫荧光检测人脐血有核细胞在脑内存活和分化情况。结果:64只大鼠,实验过程中死亡20只,正常组、模型组、脐血有核细胞组分别存活17,11,16只,进入结果分析。①缺氧缺血性脑病模型制作结果:模型组出现行为障碍,病理切片可见细胞变性坏死、胶质细胞吞噬、血管套、胶质细胞结节形成等典型缺氧缺血所致脑组织病理损伤。②第42天水迷宫试验显示:人脐血有核细胞组大鼠的空间识别和记忆能力明显尤于模型组(P<0.01),与正常对照组差异无显著性。③病理切片、苏木精-伊红染色和间接免疫实验结果显示:人脐血细胞组,进针部位存在大量移植细胞,成团或散在分布,呈方向性向周围迁移;左侧大脑血管壁,可见大量细胞迁移环绕;所植入的细胞中胶质纤维酸性蛋白表达率约为4.59%,神经元特异烯醇化酶阳性表达率约为2.68%。结论:人脐血有核细胞在缺氧缺血脑损伤新生大鼠脑内可以部分存活,表达胶质纤维酸性蛋白、神经元特异烯醇化酶抗原,并有效改善缺氧缺血性新生大鼠的功能缺陷。     

再生障碍性贫血患者T细胞功能和数量的研究

近年来许多报导证实再障患者CD8~ 细胞增多,但CD8~ 细胞中包含的抑制性T细胞的功能尚未见报导。本文采用自发性抑制细胞活性测定法研究了再障患者抑制细胞功能状态,并观察了再障患者淋巴细胞     

不同级别小鼠来源的骨髓细胞对制备优势DC2的影响

目的探索不同级别小鼠来源的骨髓细胞对体外制备优势DC2细胞的影响。方法取SPF级和健康普通级C57BL/6小鼠股、胫骨骨髓细胞及脾细胞,设细胞因子诱导的实验组、低浓度GM-CSF对照组、无外源细胞因子对照组及脾细胞组。骨髓细胞采用GM-CSF,IL-4,Flt3L和SCF的不同细胞因子浓度和组合体外培养诱导。脾细胞培养2d去除大部分淋巴细胞,第3天采用流式细胞术4色荧光标记法分析细胞表型,骨髓细胞诱导的各组同样于第3天采用流式细胞术分析细胞表型,比较不同级别小鼠骨髓细胞所诱导的DC2细胞的表型和比例。结果SPF来源的小鼠骨髓细胞诱导的各组第3d在CD11c+的DC细胞群中CD8α+DC2所占比例及不成熟DC2的比例均高于普通级小鼠,显示普通鼠来源的骨髓细胞更倾向于产生成熟的DC,不易诱导产生高比例的不成熟的DC2。对两种动物脾细胞DC2的分析结果表明,普通鼠脾脏中CD8α-MHCⅡ+的成熟DC1比例为75.58%,远远超过SPF鼠的30.60%。结论小鼠的微生物级别可影响耐受性DC的诱导效果,采用SPF级小鼠来源的骨髓细胞体外制备优势DC2细胞效果优于普通级鼠,原因可能与普通鼠接触微生物较多,免疫系统更易于产...     

体外诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞的初步研究

目的 初步研究诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系向神经细胞定向分化可能性,为青光眼等视网膜视神经疾病的治疗提供可能的途径。方法 以Buffalo大鼠肝细胞培养上清进行胚胎干细胞ES－D3细胞系培养,参照Bain等方法进行改良,以视黄酸对ES－D3细胞进行分化诱导,1d后加入阿糖胞苷,相差显微镜下观察细胞生长情况。结果 加入视黄酸后1d,相差显微镜下可见散在1个、2个或多个突起的神经样细胞。加入视黄酸后2d、阿糖胞苷后第1d,可见大量1条、2条或多条突起的神经样细胞,并相连成网络结构。结论 视黄酸辅以阿糖胞苷在体外可成功诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系成为神经样细胞,并形成网络,结合我们裸鼠眼内接种ES－D3细胞分化为神经细胞样细胞研究结果,胚胎干细胞定向分化及移植,可望成为青光眼等视网膜视神经疾病治疗的一个新的途径。     

FAA基因治疗及其基因表达调控序列新型重组载体的构建、鉴定

目的：Y国探索新型逆转录病毒载体Lentivector及其基因表达调控序列在造血细胞中的有效表达和基因治疗中的应用,用分子克隆的方法构建Fanconis Anemis(FA)患者A组基因（FANCA基因）基因治疗新型重组载体（Lentivector)和基因表达调控序列（启动子/增强子）,进一步通过内切酶酶切位点鉴定插入的基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小、目的原基因特异引物PCR扩增特异片段鉴定目的基因。方法：首先次质粒Friend基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小、目的基因特异引物PCR扩增特异片段鉴定目的基因。方法：首先将质粒Friend基因表达调控序列（Fr-MuLV E/P)强启动子/增强子插入载体Lentivector pRRLsin-18中相应克隆位点,成为pRRLsin-18FrMuLV(test1);用NotI、NcoI双酶 切载体FochA-FANCA,低溶点胶回收FANCA目的基因片段;应用polylinker、adapter方法多步克隆插入新型载体Lentivector pRRLsin-18(test1)中相应特异克隆位点,获得重组载体sin-18FrMuLVE/P-FA(test2),通过酶切鉴定重组载体插入的基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小和方向,筛选正向阳性重组质粒,用PCR法进一步证实插入的FANCA基因片段。结果：挑取的阳性克隆经多个酶酶切鉴定,有Friend质粒390bp基因表达调控序列（Fr-MuLVE/P)和4.5kbFANCA目的基因片段酶切位点,用PCR引物扩增出目的基因相应片段,证明为正向重组体。结论：已成功构建表达FANCA基因的重组逆转录病毒载体及其基因表达调控序列,为进一步应用FANCA基因的新型重组载体Lentivector经包装后转染造血干细胞及其表达情况和相应的FAA基因治疗奠定了良好的工作基础。