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目的:利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为基因佐剂,提高东部马脑炎病毒E2基因重组质粒的免疫效果.方法:分别扩增E2基因与GM-CSF基因,连接进入含有内部核糖体插入位点(IRES)的真核表达载体中,构建共表达质粒.Lipofectamine2000介导转染真核细胞BHK-21,反转录PCR检测E2和GM-CSF两个基因的转录,Western印迹法和间接免疫荧光法(IFA)检测细胞内E2基因表达产物的抗原性.通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,IFA法测定血清抗体效价,FACS测定免疫小鼠脾细胞中CD4 /CD8 淋巴细胞构成比,初步观察共表达质粒的免疫原性.结果:经酶切鉴定与序列测定证明重组共表达质粒中含有E2和GM-CSF两个基因且序列正确.转染细胞的反转录PCR可见E2和GM-CSF两个基因的转录.Western印迹结果可见转染细胞的裂解液在相对分子质量50 000位置有特异性条带.将转染细胞制成荧光抗原片,经IFA检测可见胞浆中出现特异荧光.免疫小鼠的最高血清抗体效价为1:160,但细胞免疫未观察到明显的提高.结论:构建的共表达质粒pE2-IRES-mGM-CSF具有良好的免疫原性,能有效刺激小鼠特异性体液免疫应答,提高了E2基因重组质粒诱导的血清抗体效价. 相似文献
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森林脑炎病毒prM-E蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫活性测定 总被引:1,自引:1,他引:1
目的为了表达森林脑炎病毒prME蛋白,为森林脑炎快速诊断试剂的研制奠定基础。方法经过RTPCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,以杆状病毒昆虫细胞表达系统成功地表达了森林脑炎病毒MDJ01株prME蛋白。结果从感染细胞上清中电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,说明重组病毒感染细胞后产生病毒样表达颗粒(viruslikeparticlesVLPs),并且分泌至细胞外。免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的重组蛋白能够与抗森林脑炎病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性。ELISA和间接免疫荧光染色证实,重组prME蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在昆虫细胞中表达的prME具有良好的抗原性,本研究为森林脑炎快速特异诊断试剂研制奠定了基础。 相似文献
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人源H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性和致病性研究 总被引:1,自引:1,他引:0
目的观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性,对比研究不同空斑类型H5N1病毒致病性和复制能力差异。方法将不同稀释度的H5N1亚型禽流感病毒株分别接种于MDCK单层细胞,加盖营养琼脂,合适时间染色,观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑形成特点,按照DullbeccoR的方法计算病毒PFU数;根据空斑大小进行挑选、纯化、筛选不同类型空斑病毒,测定这些病毒对Balb/c小鼠致病性差异和在MDCK细胞上复制差异。结果野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,空斑大小、形状差异明显:A/Vietnam/1194/2004(H5N1)以大圆形斑为主,夹杂少量小点状斑。A/Beijing/01/03(H5N1)大多数为中等大小空斑,并有少数针尖状斑。野生A/Vietnam/1194/2004经过分离纯化后,得到的两种空斑类型病毒在致病性和复制能力存在明显差异。结论野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,从野生病毒株中分离、纯化的大小斑病毒在致病性和复制能力上存在明显差异。 相似文献
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目的 建立能分泌具有中和活性的抗SARS-CoV单克隆抗体(McAb)细胞株,制备有中和活性的抗SARS-CoV MeAb,用于SARS-CoV感染的早期特异诊断和进行SARS-CoV结构蛋白的功能研究。方法 用灭活纯化sARS-c0V(BJ01株)免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,建立能稳定分泌SAILS病毒MeAb的杂交瘤细胞系,然后用中和试验进一步筛选分泌具有中和活性的抗SARS-CoV MeAb细胞株。利用SARS-CoV的S和N蛋白的不同长度肽段通过EusA鉴定McAb的特异结合区域,分析S和N蛋白不同区域诱导产生抗体的能力和特性。结果 建立了12株能稳定分泌抗SARS-CoV McAb的杂交瘤细胞株,间接免疫荧光法检测抗体效价在1:320~1:20 480之间,其中6株具有较好的中和SARS-CoV的能力。具有中和活性的McAb中,3株是针对S蛋白的,2株是针对N蛋白的。其中抗S蛋白的中和抗体活性比抗N蛋白的中和抗体活性高,另外1株可能是针对SARS-CoV的其他结构蛋白的。进一步对6株抗S蛋白的McAb的特异抗原结合表位分析,发现其中3株结合位点在S蛋白第12~311氨基酸之间,2株在第310~535氨基酸之间,后者中和效价高于前者,另1株是针对S2蛋白的,SARS病毒的受体结合区正位于第310~535氨基酸这一区段。具有中和活性的McAb通过间接免疫荧光、ELISA、酶标免疫组化法和胶体金方法对SARS病毒进行检测,都显示出高度的特异性和良好亲和力。结论 成功制备了具中和活性的抗SARS-CoV单克隆抗体,并分别测定了McAb对S蛋白和N蛋白的特异抗原结合活性,初步确定了S蛋白的中和表位。为今后SARS病毒的特异诊断、结构蛋白的功能分析和重组疫苗的研制奠定了较好的基础。 相似文献
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登革病毒(DEN)抗原成分复杂,与许多虫媒披膜病毒都有严重的血清学交叉反应。杂交瘤单克隆抗体(Mcab)技术建立之后,Dittmar等人首先制备出了抗DEN-3病毒的McAb,可进行DEN-3病毒的鉴定分型。随后,Henchal等人制备出了抗DEN1-4型病毒的McAb,用这些McAb进行DEN病毒抗原决定簇研究,依据间接免疫荧光染色(IFA)证实了DEN病毒的四种不同抗原决定簇,即:黄病毒属特异的、DEN-1-4型病毒特异的、DEN-1、3型病毒特异的和DEN病毒各型型特异的。阎国珍等人在研究抗DEN-4病毒McAb时,获得了抗DEN-2、4型病毒特异的McAb,证明DEN-2和DEN-4病毒间有共同特异抗原决定簇。本文介绍通过用抗DEN-3病毒McAb对不同披膜病毒抗原交叉反应测定来分析鉴定 相似文献
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河南新乡2008年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:对2008年分离自河南新乡手足口病患者粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法:将手足口病患者粪便标本接种敏感细胞进行分离传代培养,制备抗原片进行间接免疫荧光检测,采用特异性引物进行PCR鉴定,将病毒基因组分为8个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果:测序获得的3株EV71病毒基因组全长均为7 405 nt,VPI氨基酸序列同源性达100%.Blast分析表明F3(F8)-Henan-08毒株均与安徽阜阳2008年分离的EV71毒株同源性最高,而F4-Henan-08毒株与我国台湾省2004年分离的EV71毒株同源性最高.序列进化分析表明,新分离毒株属于C4基因亚型.结论:新分离的河南EV71毒株与安徽阜阳分离的毒株可能具有相同来源. 相似文献
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1株辛德毕斯病毒基因组编码区序列测定及分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:对保存的一株辛德毕斯病毒基因组编码区序列进行测定,阐明其与已报道毒株序列的差异.方法:对辛德毕斯病毒基因组编码区进行分段RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,采用DNA Star软件将分段测序结果拼接得到全长编码区序列.结果与结论:此株辛德毕斯病毒基因组编码区全长11 322 nt,编码3 774个氨基酸,其中非结构基因长7 539 nt,编码4种非结构蛋白NSp1,NSp2,NSp3,NSp4;结构基因全长3 735 nt,编码5种结构蛋白E1,E2,E3,6K和C蛋白.非结构基因和结构基因之间有48 nt的不翻译连接区.序列同源性分析结果表明,此株病毒与HRsp株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.7%,氨基酸序列同源性为99.6%.此株病毒与HRsp株病毒亲缘性最高,同属于南非-欧洲组. 相似文献
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登革热是东南亚地区由虫媒病毒引起的重要传染病之一。在登革病毒1—4型中,以4型病毒引起的病情最严重,出血型病例多,病死率高。我国在1978—1980年间,曾连续发生了登革热的暴发流行。在病原诊断中,用白纹伊蚊C6/36细胞大大提高了病毒分离率,但在鉴定分型中,因交叉反应明显造成困难。由于登革病毒具有型间和组间的共同抗原,故用一般的动物免疫血清或免疫腹水进行鉴定分型时,交叉反应难以克服。采用淋巴细胞杂交瘤技术,能够制备出对病毒单一抗原决定簇的单克隆抗体,可以很好地解决上述交叉问题。国外已有登革3型和2型病毒单克隆抗体的报导。为了平时和战时提供登革病毒型特异的诊断制剂,解决 相似文献
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3种重要虫媒病毒的RT-PCR检测 总被引:2,自引:1,他引:1
目的:建立快速、敏感、特异的虫媒病毒RT-PCR检测方法。方法:采用改进的核酸制备方法,分别从感染的乳鼠脑和细胞培养上清液中提取病毒RNA,再用RT-PCR和套式PCR方法进行检测。结果:通过对肌PCR反应条件的优化,用3种虫媒病毒的特异引物均可从不同稀释度的感染小鼠脑和细胞上清中提取的病毒RNA扩增出特异的目的基因片段。甲病毒属的东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒之间,及与黄病毒属的黄热病毒均无交叉反应,表明建立的RT-PCR检测方法特异性强。套式PCR与肝PCR比较可提高检测敏感性10~10000倍。结论:建立的肝PCR和套式:PCR法可用于3种虫媒病毒的快速检测。 相似文献