登革病毒(NGC株)C与prM全长基因的扩增与克隆

目的　从登革病毒 (NGC株 )中快速分离基因组RNA ,RT -PCR扩增及克隆C和 prM全长基因 ,从而为研究蚊虫细胞对登革病毒的细胞内免疫研究奠定基础。方法　以Trizol试剂从C6 / 36细胞培养上清中提取基因组RNA ,RT -PCR扩增全长C和 prM基因 ,T -A重组入pGEM -T载体 ,重组质粒的双酶切、PCR与测序鉴定。 结果与结论　应用Trizol试剂从蚊细胞培养液上清中快速分离到高纯度和完整登革病毒RNA基因组 ,成功扩增与克隆出全长登革病毒C和 prM基因     

白纹伊蚊和致倦库蚊Wolbachia 16S rRNA序列测定与分析

【目的】PCR法扩增与测定白纹伊蚊和致倦库蚊的细胞内共生菌 Wolbachia16SrRNA序列 ,分析其种系发生关系及传播方式。【方法】从单只雌蚊中提取DNA ,PCR法扩增 16SrRNA序列 ,扩增产物进行克隆及测序。【结果】从白纹伊蚊和致倦库蚊分别扩增出Wolbachia 16SrRNA序列 ,并克隆入 pGEM T载体 ,测序证明两序列长度分别为 897bp。【结论】成功克隆了白纹伊蚊和致倦库蚊Wolbachia 16SrRNA序列。测序和同源性分析表明 ,它们之间的同源性为 99 9%,提示Wolbachia在白纹伊蚊和致倦库蚊可能存在水平传播的方式。     

不同蚊宿主体内马来丝虫微丝蚴黑化的实验比较

羽化1～2天的中华按蚊.致倦库蚊和白纹伊蚊分别胸内接种马来丝虫微丝蚴,在接种后的第3、4、5和9天,分头、胸、腹3部解剖计算各种蚊虫体内黑化微丝蚴及发育各期幼虫。结果表明:中华按蚊、致倦库蚊和白纹伊蚊的微丝蚴黑化率分别为51·6％、86·1％和69·5％,差异显著;3种蚊虫体内的感染期幼虫率及感染期幼虫阳性率分别为35.3％、1·6％、0％和83·9％、23·5％、0％。黑化微丝蚴较多地集中在蚊虫腹部,占黑化微丝蚴总数61·6％～78·4％。     

CYP4基因表达量在致倦库蚊溴氰菊酯抗性株和敏感株生活史各期中的初步研究

本用磁性分离法直接从蚊虫组织中提取mRNA．用地高辛标记的p450 CYP4基因片断为探针与mRNA杂交．检测致倦库蚊溴氰菊酯抗性株和敏感株生活史各期中CYP4基因表达量的变化情况。结果显示：两株的生活史各期中CYP4基因的表达量以幼虫为最高，蛹期最低，而抗性株与敏感株间同期的CYP4基因表达量未见显差别。     

致倦库蚊溴氰菊酯抗性株细胞色素P450基因的克隆,鉴定及同 …

根据果蝇的ＣＹＰ４Ｄ１保守区氨基酸序列，设计了１对简并引物，从致倦库蚊溴氰菊酯抗性株的基因组ＤＮＡ中，扩增出１条特异性ＤＮＡ片段，其大小与设计的细胞色素Ｐ４５０基因片段相符。将这个片段与ｐＵＣ１９质粒重组，并克隆到ＤＨ５α大肠杆菌中，经筛选后测序，得到１条长４５６的核酸序列。将推导的氨基酸序列进行同源性分析，表明该序列与ＣＹＰ４家族成员同源性较高，提示该序列属于ＣＹＰ４家族；该序列与ＣＹＰ４Ｊ亚家     

家蝇拟除虫菊酯抗药性的分子生物学监测

目的　建立一种可以早期检测昆虫拟除虫菊酯抗药性的方法 ,以利于抗药性的控制。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)方法 ,用自行设计的特异引物 ,对昆虫的钠离子通道基因进行扩增。结果　共检测敏感家蝇和溴氰菊酯抗性家蝇各 2 0只 ,在所有抗性家蝇的钠离子通道基因中均扩增出特定大小基因片段 ( 183bp) ,表明基因发生了抗性突变。而在所有敏感家蝇的钠通道基因中均未扩增出该基因片段 ,表明未发生基因突变。结论　PCR能够在短时间内完成对昆虫拟除虫菊酯抗性的检测 ,为早期监测昆虫对拟除虫菊酯的抗药性提供了快速可行的方法。     

基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义

目的：快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因（CYP6N3）上游启动子区序列。方法：根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′－末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物（GSP1和GSP2）,利用4种限制性内切酶Dra I、EcoRV、PvuⅡ和Stu I分别消化白纹伊蚊溴氰酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库（DL1、DL2、DL3及DL40,并分别以此为模板,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增。结果：第1步PCR结果显示：在上述4种消化文库中分别扩增出约806、2190、2206和3076bp的特异条带;第2步PCR结果与第1次PCR相类似,但各泳道主带扩增效率明显升高。结论：本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3上游启动子区核苷酸序列及其4种限制性内切酶图谱。此外还对基因步移法是在昆虫细胞色素P450多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论。     

昆虫CYP6家族与抗药性及其转录调控

已知昆虫细胞色素 P4 50单加氧酶是一类具有多样性的酶 ( Feyereisen,1 999) ,在各种杀虫剂如拟除虫菊酯、有机氯化合物、有机磷化合物及氨基甲酸酯类化合物等的代谢中起重要作用 ( Feyereisen,1 995)。目前已鉴定的昆虫细胞色素 P4 50有 8个家族 ( Scott etal.,1 988) ,但并非每一个家族均与昆虫抗药性有关。通过资料分析显示其中 CYP6家族成员与昆虫抗药性关系密切。有关昆虫 CYP6家族多样性与进化 ,本文作者已另文综述。另外 ,已知细胞色素 P4 50单加氧酶对杀虫剂的代谢抗性是由于基因表达调控尤其是转录调控的改变所致 ( Feyereis…     

登革病毒prM基因真核表达载体的构建及在白纹伊蚊细胞C6/36中的表达

目的　构建登革病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达。方法　将prM基因亚克隆入真核表达载体 pEGFP -N3,转化大肠杆菌JM 10 9,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定 ,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6 / 36细胞并使其表达 ,利用RT -PCR法检测目的基因的转录 ,Western -blot检测融合蛋白的表达。结果　成功构建了 pEGFP -prM重组质粒 ,RT -PCR证明 prM基因在蚊细胞内的转录 ,Western -blot检测到 prM -GFP融合蛋白的表达。结论　成功构建登革了病毒 prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达 ,为进一步研究细胞内免疫的分子机制及构建转基因蚊虫奠定了基础