黄曲霉毒素B1诱发树鼩肝癌过程中的差异表达蛋白质分析及意义

目的比较黄曲霉毒素B1(AFB1)诱发的树鼩肝细胞癌生长不同阶段的蛋白质表达谱的改变,筛查在AFB1诱发的肝癌发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子.方法用双向电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法(MALDI-TOF-MS/MS)对同一动物自身的癌发生前肝组织(A45W),癌发生后的肝癌组织(ACa)及未经AFB1处理的对照组动物肝组织(E45W)进行了相互比较.结果A45W组、ACa组、E45W组分别平均检测到(1 255±43)个蛋白点(n=3)、(1 198±50)个蛋白点(n=3),和(1 252±40)个蛋白点(n=3),以其中A45W组图谱为参考胶,ACa组、E45W组分别与其匹配的平均匹配点数为(818±39)个(n=3)和(777±45)个(n=3),平均匹配率分别为66%和62%.癌与癌前比(ACa vs A45W),相差2倍以上的上调点和下调点分别为108个(包括癌特异点)和75个;癌前与未经AFB1处理的对照组比(A45W vs E45W),相差2倍以上的上调点有78个,下调点有21个.质谱可鉴定出不均一核糖核蛋白A1、不均一核糖核酸核蛋白A2/B1、peroxiredoxin 1、peroxiredoxin 2、膜联蛋白4、肌球蛋白α链等26种胶内差异蛋白质.结论在AFB1诱发的树鼩肝癌发生不同阶段有明显的差异性蛋白表达谱,为进一步对人肝癌蛋白质组的研究提供了线索.     

RNAi沉默MCM7基因对人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠移植瘤影响研究

目的探讨微小染色体维持蛋白7(miniehromosome maintenanceprotein7,MCM7)基因RNAi(RNA interference)的重组慢病毒载体,对人肝癌细胞SMMC-7721 MCM7基因表达和裸鼠移植瘤生长的影响。方法构建重组逆转录慢病毒载体MCM7-shRNA,以MCM7基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-MCM7)感染SMMC-7721细胞,作为实验组;以对照慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)感染SMMC-7721细胞,作为阴性对照组;空白对照组常规培养,不做任何处理。通过嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。3组细胞分别接种至裸鼠皮下,建立人肝癌裸鼠移植瘤模型。观察裸鼠成瘤情况、移植瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线;4周后测定肿瘤体积和质量,并用RT-PCR、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法及免疫组织化学法检测移植瘤中MCM7的表达情况。结果 MCM7-shRNA慢病毒载体构建成功。裸鼠接种癌细胞后第6天均有肿瘤形成,与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的肿瘤生长速度明显减慢,实验组、阴性对照组和空白对照组的瘤体平均体积分别为(27.72±7.80)、(81.86±10.91)和(79.75±16.61)mm3,差异有统计学意义,F=61.949,P<0.05;实验组、阴性对照组和空白对照组的瘤体平均质量分别为(0.19±0.06)、(0.501±0.14)和(0.509±0.18)g,差异有统计学意义,F=18.41,P<0.05。实验组MCM7mRNA的相对表达量为0.253±0.198,阴性对照组1.213±0.548,空白对照组1.201±0.744,实验组相比阴性对照组和空白对照组明显下降,差异有统计学意义,F=4.091,P<0.05;实验组MCM7蛋白相对表达量为0.207±0.015,阴性对照组1.116±0.062,空白对照组1.088±0.040,实验组相比阴性对照组和空白对照组明显下降,差异有统计学意义,F=292.778,P<0.05。MCM7蛋白在阴性对照组和空白对照组中阳性表达率均为100%(10/10),在实验组中为30%(3/10),实验组明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义,χ2=18.261,P<0.001。结论慢病毒沉默SMMC-7721细胞MCM7基因表达能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,MCM7基因可能成为肝癌基因治疗的有效靶点。     

CCT亚基γ基因在AFB1诱发大鼠肝癌过程中表达的变化

目的 探讨 AFB1 诱发肝癌过程中 CCT 亚基 γ 基因蛋白的表达及其意义.方法 45 只 Wistar 大鼠随机分为AFB1 组和对照组,AFB1 组以 200滋g/kg 体重腹腔注射 AFB1,第 13 周、第 33 周和第 53 周对大鼠进行肝活检,第 73 周处死全部动物并取肝组织.用免疫组化法检测AFB1 诱发肝癌过程中不同时期CCT亚基γ基因蛋白的表达情况.结果 在第 73 周 AFB1 组 CCT亚基γ基因蛋白表达水平显著高于对照组(P约0.05).同一组不同时段比较,随着诱癌的进行,CCT亚基 γ 基因蛋白表达上调,第 73 周 AFB1 组 CCT亚基 γ 基因蛋白的表达水平不仅明显高于第 13 周,而且亦高于第 33周(P约0.01).其余各组和同组不同时段之间CCT亚基γ基因蛋白的表达差异无统计学意义(P跃0.05).AFB1 组中发生肝癌的动物肝组织 CCT 亚基 γ 基因蛋白表达率为 100%(10/10),显著高于同期对照组 CCT 亚基 γ 基因蛋白的表达率30%(3/10)(P约0.05).结论 AFB1 诱癌过程中CCT亚基γ基因蛋白表达上调,CCT亚基 γ基因蛋白有可能参与了肝细胞癌的发生和发展.     

二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中癌前病变阶段差异表达蛋白质的筛选

目的 通过比较二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝细胞癌发生过程中不同阶段的蛋白质表达谱,筛选在大鼠肝癌前病变阶段起重要作用的蛋白质分子. 方法大鼠分为DEN组和正常对照组,诱癌过程中定期处死动物并取其肝组织;以γ-谷氨酰转肽酶染色阳性的肝细胞增生灶为标志,识别和获取肝癌前病变的组织标本.用双向电泳及基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法对大鼠正常肝组织、癌前病变组织和肝癌组织的全蛋白质组表达谱进行比较和鉴定.用Western blot和RT-PCR方法对部分差异表达蛋白质(如层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶)进行表达水平的验证.结果 筛选出表达水平差异≥2倍的蛋白质共82种,其中在癌前病变阶段即发生明显改变的差异表达蛋白质有47种,包括在正常对照组、癌前病变组、肝癌组呈现依次上调的层黏连蛋白受体1等8种蛋白质和在上述组织中呈现依次下调的鲱精胺酶等22种蛋白质.Western blot和RT-PCR方法对层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶表达水平的验证结果与双向电泳的结果相似.结论 大鼠肝癌形成过程中不同阶段的蛋白质表达谱有所不同,对癌前病变的差异表达蛋白质如层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶等进行深入探讨,有望为人类肝癌的早期诊断和治疗提供线索.     

新生期树鼩接种人乙型肝炎病毒的长期实验观察

目的 观察新生期树鼩接种HBV后体内HBV感染标志物的长期动态.方法 6只树鼩于新生期接种人HBV DNA阳性血清,每4-6周抽血1次和每6～12周做肝活体组织检查1次,应用巢式聚合酶链反应(nPCR)、荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)、Southern blot、酶联免疫吸附试验和免疫组织化学染色等方法动态观察血清和肝组织中HBV感染标志物的消长,用电镜寻找肝组织内的HBV颗粒和用光镜观察肝组织病理变化.结果 新生期树鼩接种后48周,3只动物(1、2和6号)血清和肝组织标本经多对引物进行的nPCR,均稳定显示HBV DNA阳性,肝组织HBVcccDNA阳性;FQ-PCR显示血清和肝组织HBV DNA的拷贝数分别为103-104/ml和每微克肝组织总DNA 107～108拷贝;Southern blot检测显示肝组织存在HBV复制中间体HBV cccDNA和HBV单链DNA;酶联免疫吸附试验检测显示血清HBsAg持续阳性;免疫组织化学染色可见数量逐步增多的HBsAg阳性肝细胞.其中的1号动物至接种后2年每微克肝组织总DNA仍可测得107～108拷贝的HBV DNA,电镜下可见疑似HBV颗粒.另3只动物除nPCR显示肝组织HBV DNA阳性条带和FQ-PCR显示低拷贝数(每微克肝组织总DNA103拷贝)HBV DNA外,其余的HBV感染标志物均为阴性或一过性阳性.结论 新生树鼩能够长期感染HBV,并且HBV能够在树鼩体内稳定复制和长期存在.     

胸腺素β10在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的 探讨人肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者组织胸腺素β10 (Thymosin beta-10,Tβ10) mRNA的表达及其临床意义.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测70例HCC患者癌组织、癌旁肝组织及18例正常肝组织中Tβ10 mRNA的表达情况,分析Tβ10 mRNA表达水平与肝癌患者的临床分期、有无术后复发、有无肝外转移、有无门静脉癌栓、肿瘤个数、肿瘤直径、血清AFP水平和病理分级等指标的关系.结果 Tβ10 mRNA在正常肝组织(1.30±0.53)及癌旁肝组织(1.21±0.50)中的表达水平明显高于在HCC组织(1.01±0.41)中的表达水平(P＜0.05),而在正常肝组织及癌旁肝组织中的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).Tβ10 mRNA在人HCC组织中的表达与门静脉癌栓、肿瘤个数及肿瘤直径明显相关(P＜0.05),而与临床分期、肝外转移及术后复发、血清AFP 水平及分化程度无明显关系(P＞0.05).结论 Tβ10 mRNA在HCC组织中低表达,可能与HCC的发生、发展的早期阶段有关.     

银杏叶提取物对黄曲霉毒素B1诱发Wistar大鼠肝癌的影响

[目的]通过建立黄凿霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)诱发Wistar大鼠肝细胞癌(HCC)模型,用银杏叶提取物(extract of Ginkgo Biloba Leaf,EGb761)进行干预,观察EGb761对AFB1致大鼠HCC作用的影响. [方法]实验大鼠按体重随机分成3组:A组(AFB1组)、B组(AFBI+EGb761组)和C组(空白对照组).于实验第14、28、42及55周给予肝活检并于第64周全部处死大鼠,观察大鼠肝脏γ-GY灶及HCC发生情况. [结果]在出癌前期,第42及第55周时,A组每个γ-GT阳性灶的面积分别为(7.95±0.30)mm2及(17.87±0.71)mm2,单位面积(cm2)灶的个数分别为0.35±0.006及0.26±0.004,灶总面积分别为(2.54±0.05)mm2/cm2及(4.68±0.12)mm2/cm2;B组在相同时段的相应指标,分别为(4.65±0.16)mm3及(9.03 4±0.35)mm2, (0.21 4±0.006)及(0.20±0.005),(0.97±0.03)mm2/cm2及(1.62±0.06)mm2/cm2.除了55周A、B两组的单位面积γ-GY阳性灶的个数无统计学差异外,各时段B组各项指标都显著小于A组(P=0.000).两个实验组共有28只大鼠发生恶性肿瘤,对照组无肿瘤发生.B组HCC诱发率(7/26,26.92%)明显低于A组(19/25,76%) (P=0.000).另外,HCC及其他肿瘤的发生时间,B组明显推迟.[结论]EGb761能明显抑制AFB1诱发大鼠肝的癌前病变及延迟癌前病变向癌发展.     

MTA1表达与乳腺癌浸润转移的关系

[目的]探讨转移相关基因1（metastasis assiciated gene 1，MTA1）在乳腺癌浸润与转移中作用。[方法]用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术联合Zvmed^TM免疫组化方法分别检测55例乳腺癌、癌旁组织中MTA1mRNA和蛋白表达情况。[结果]MTA1 mRNA在乳腺癌中阳性表达率为52．7％（29／55）．在癌旁乳腺组织的阳性率23．6％（13／55）：两者比较差异有统计学意义（P〈0．05）。MTA1蛋白在乳腺癌组织中阳性表达率为49．1％（27／55），在癌旁乳腺组织中阳性表达率为16．4％（9／55）：两者比较有统计学差异（P〈0．01）。MTA1在乳腺癌组织中的阳性检出率与临床分期、淋巴结转移数目（〉4）、病理分级和C-erbB-2阳性相关（P〈0．05），与年龄、ER、PR无明显关系（P〉0．05）。[结论]MTA1对乳腺癌浸润、转移可能有促进作用。有可能成为预测乳腺癌浸润与转移的参考指标。     

银杏叶提取物（EGb761）对乙型肝炎病毒抗原分泌的抑制作用

目的探讨银杏叶提取物对乙型肝炎病毒分泌抗原的抑制作用。方法用不同浓度的银杏叶提取物作用于HepG2.2.15细胞。期间分不同的时间段用MTT法检测银杏叶提取物对HepG2.2.15细胞的毒性作用并收集细胞上清,用酶联免疫吸附法定量检测细胞上清中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及乙肝e抗原（HBeAg）。结果银杏叶提取物对HepG2.2.15细胞没有明显的毒性作用;经银杏叶提取物作用过的细胞,其培养上清中的乙肝表面抗原及乙肝e抗原明显少于未加该药作用者。结论银杏叶提取物可以抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg及HBeAg,且对细胞没有明显的毒性作用。     

树鼩乳汁的主要成分检测及其意义-修改稿

目的 探讨树鼩乳汁的基本成份,并和其它乳制品成份进行了比较分析。方法 采用无菌操作的方法,用注射器直接采取2只母树鼩分娩22d后的乳汁,1次/天,连续3天,每只母树鼩采取18ml乳汁,按照国家标准的方法进行成分检测。结果 发现树鼩乳总固形物为44.88％、脂肪为23.66％、蛋白质为8.75％、乳糖为0.47％、灰分为0.73％。与牛乳相比,树鼩乳总固形物、蛋白质和脂肪含量高于牛乳,而乳糖含量低于牛乳。与婴幼儿配方奶粉相比,树鼩乳的蛋白质、乳糖含量低于婴幼儿配方奶粉,而脂肪含量远高于婴幼儿配方奶粉。树鼩乳脂肪含量远高于婴幼儿配方奶粉和牛乳的1.39和6.07倍,乳糖含量远低于婴幼儿配方奶粉和牛乳的14.5和10.4倍。结论 树鼩乳的主要营养成分呈现高脂高蛋白低糖,可为树鼩人工育幼和饲养工作提供依据。