不同分离方法与培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况比较

目的:应用贴壁分离法和密度梯度离心法以不同培养条件观察纯化过程中对获得的骨髓间充质干细胞的影响,试图寻找获得高质量、高活性的骨髓间充质干细胞的培养条件。方法:实验于2005-09/2006-01在解放军第四军医大学实验动物中心实验部进行。①SPF级雄性Wistar大鼠18只,贴壁分离培养取12只,根据血清和培养基的不同分为4组:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组,3只/组。密度梯度离心培养实验取剩余6只,以分离液的不同分为Ficoll分离液组、Percoll分离液组,3只/组。②骨髓取材:各组大鼠断颈处死后,无菌取双下肢,剔除股骨、胫骨周围肌肉组织,剪去骨干的两端,暴露骨髓腔,穿刺两侧骨端取出骨髓。③贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组大鼠分别采用相应的血清和培养基冲洗骨髓,制备单细胞悬液,接种于培养瓶中,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每3～4d换液1次。④密度梯度离心法:Ficoll分离液组选用的Ficoll分离液密度为1.077;Percoll分离液组将Percoll分离液与0.1mol/L磷酸盐缓冲液按9∶1比例混匀,密度为1.073。将两组大鼠骨髓置入离心管,离心弃上清,轻轻叠加到相同体积的各自对应分离液上,再次离心收集界面层白色混浊液,采用F12-DMEM培养液重悬细胞,按1×109L-1的密度接种于培养瓶中,培养条件与贴壁分离法相同。⑤指标检测:倒置显微镜下,每天观察贴壁分离、密度梯度离心不同培养条件下细胞的生长情况和活体形态特征。进行锥虫蓝排斥试验,蓝染细胞为死亡细胞,在3min内用计数板分别计数活细胞和死细胞,未被蓝染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活性的数据。两种分离方法均取生长良好的第3代细胞,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。结果:18只大鼠均进入结果分析。①细胞形态观察结果:贴壁分离法:采用进口血清培养的两组细胞形态学上都表现为长梭形,细胞活性较高,且给予F12-DMEM培养基的细胞增殖较快,集落融合较早,传代所需时间短;采用国产血清培养的两组细胞中,给予F12-DMEM培养基可以获得梭形细胞,而给予DMEM培养基后则多为类圆形骨髓样细胞,仅见极少梭形细胞。密度梯度离心法:Ficoll分离液组和Percoll分离液组均可培养出梭形骨髓间充质干细胞,细胞活性均高,但集落融合、传代所需的时间均较贴壁分离法长。②细胞活性检测结果:贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组的活细胞率分别为98.3%,98.7%,97.1%,97.7%,组间比较差异无显著性意义(χ2=0.054～0.620,P均>0.05)。密度梯度离心法:Ficoll分离液组活细胞率与Percoll分离液组相似(96.9%,97.1%,t=1.066,P>0.05)。③第3代细胞生长曲线测定结果:不同培养条件下各组第3代细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;4d后细胞数均迅速增长;8d进入平台期,细胞增殖减慢。结论:采用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法,只要选择合适的培养条件均可获得骨髓间充质干细胞,但选用进口胎牛血清、F12-DMEM培养基效果较好。     

液氮深低温保存同种带瓣血管的临床应用

目的报告应用液氮深低温保存的同种带瓣血管（valved homograft conduit,VHC）纠治复杂心脏畸形的经验。方法患者男27例,女19例,年龄1.9～31（9.5±5.1）岁,体质量10～64（29.5±13.2）kg。病种包括右室双出口15例,矫正性大动脉转位9例,共同动脉干7例,肺动脉闭锁5例,法乐氏四联症4例,完全性大动脉转位3例,先天性主动脉瓣关闭不全2例,法乐氏四联症术后肺动脉瓣重度关闭不全1例。合并畸形包括肺动脉狭窄、房间隔缺损、动脉导管未闭、多发室间隔缺损等。手术均在全麻低温体外循环下进行。结果无手术死亡。早期死亡2例,分别为术后低心排综合症和呼吸道出血。存活44例,随访（32/44）3～96（30±19.5）月,死亡2例,1例右室双出口患者术后26个月死于感染性心内膜炎,另1例为矫正性血管转位患者术后8个月死亡,死因不明。其余30例患者心功能明显改善,超声心动图检查显示吻合口无狭窄,VHC管腔通畅,瓣膜无明显返流。结论液氮深低温保存的VHC是理想的人工材料,用于纠治复杂心脏畸形可获得较好的治疗效果。     

创伤性急性肺损伤时兔肺微血管内皮细胞Cx40调控内皮细胞通透性的研究

目的 观察创伤性急性肺损伤(ALI)兔血清对肺微血管内皮细胞连接蛋白40(Cx40)表达和间隙连接通道(GJC)功能的影响,及后者与内皮细胞单层通透性的关系.方法 组织块贴壁法分离、培养兔肺微血管内皮细胞.细胞分为3组,对照组、创伤血清处理组和阻滞剂组.在阻滞剂组,细胞GJC阻滞剂1-庚醇(0.5 mmol/L)加入到培养液中.1 h后,阻滞剂组和创伤血清组的20%胎牛血清的培养液均被更换为含有20%创伤血清的培养液.对照组则只更换培养液.3组细胞继续孵育6 h后,进入实验观察.分别行划痕实验、Cx40蛋白免疫印迹、单层细胞通透性和细胞内Ca2+钙浓度检测.结果 Cx40蛋白印迹见创伤血清组与阻滞剂组蛋白表达水平较对照组有明显降低,且2组之间亦不同,阻滞剂组蛋白水平较创伤血清组低,吸光度和值减少(对照组726293.2±83 684.1,创伤血清组397 798.1±87 145.7,阻滞剂组316977.6±76 325.9,n=4,P＜0.05).3组细胞划痕边缘的细胞均被染料荧光黄(LY)染色,LY在对照组细胞扩散得最远,显色的周边细胞的数量最多,创伤血清组次之,阻滞剂组显色的细胞数量最少,相邻细胞与边缘细胞比值的差异有统计学意义(23±5、11±3比7±2,n=4,P＜0.05).3组细胞伊文思蓝清除率均随着时间的延长而增加,且3组细胞间亦有不同,阻滞剂组清除率高于创伤血清组和对照组.组间差异和时间点差异均有统计学意义(P＜0.05).通过共聚焦显微镜的观察,3组细胞荧光强度不相同,阻滞剂组荧光最强,对照组最弱.创伤血清组和阻滞剂组细胞内Ca2+浓度均显著高于对照组[(494.80±41.94)、(569.80±6.70)nmol/L比(158.80±13.09)nmol/L,P＜0.05].结论 创伤性ALI动物血清抑制肺微血管内皮细胞Cx40表达,进而引起GJC功能下降,导致肺血管内皮细胞单层通透性增加,该机制可能参与了胸部创伤后肺血管通透性增加的形成,促进了伤后急性肺损伤的发病.

Abstract：

Objective To investigate the influence of traumatic acute lung injury (ALI) rabbit serum on gap junction channel ( GJC ) function and connexin40 ( Cx40) expression, and the correlation of GJC and Cx40 with rabbit pulmonary microvascular endothelial cells permeability. Methods Cultured pulmonary microvessel endothelial cells were divided into three groups, control ( Gcontrol) , injured serum (Gserum) , and blocker agent ( Gblocker). GJC function was assessed by scrape-loading and dye transfer techniques. Pulmonary microvessel endothelial cells permeability was measured by Evans blue-labeled albumin transfer, and the expression of Cx40 was measured by Western blotting. Intracellular free calcium concentration was measured by fluo-3am. Results Injured serum decreased GJC function and the level of Cx40,which was aggravated by the GJC blocker (control 726 293. 2 ± 83 684. 1, serum 397 798. 1 ± 87 145. 7, blocker 316 977. 6 ±76 325. 9,n=4,P ＜0. 05). Similarly, pulmonary microvascular endothelial cells permeability was increased significantly in Gserum and Gblocker as compared with Gcontrol (P ＜0. 05). After treatment with injured serum in combination with gap junction blocker in vitro, intracellular free calcium concentration was increased [control (494. 80 ±41.94) nmol/L, serum (569. 80 ±6. 70) nmol/L, blocker (158. 80 ±13. 09) nmol/L, P＜ 0.05]. Conclusion Traumatic ALI rabbit serum inhibits the Cx40 expression and down-regulates GJC function, which contributes to the increase of pulmonary microvascular endothelial cells permeability after ALI This mechanism may participate in the increase of pulmonary vascular permeability and promote the morbidity of ALI after trauma.     

兔胸部撞击伤后呼吸功能的改变

目的建立胸部撞击伤后急性呼吸窘迫综合症(ARDS)模型。方法65只兔分为对照组(n=5)和实验组(LV组、MV组、HV组,n=20)。对照组不致伤,实验组以不同速度撞击右侧胸壁。伤前、伤后4、12、24、48、72h检测动脉血气、肺干湿重比、支气管肺泡灌洗液总蛋白含量和胸部X线检查,观察肺组织苏木精伊红染色和肿瘤坏死因子α(TNFα)表达。结果LV组死亡率10%,5%动物出现ARDS,肺病理变化较轻。MV组死亡率15%,25%动物出现ARDS,总蛋白含量和肺病理较LV组明显,但较HV组轻微。HV组死亡率40%,60%动物出现ARDS。伤后24h氧合指数降到191.3mmHg(1mmHg=0.133kPa),72h为153.81mmHg。肺干湿重比明显低于对照组,总蛋白含量明显高于对照组。肺泡结构严重破坏,大量红细胞、炎细胞渗出,肺间质肿胀增厚。左侧肺间质肿胀和大量炎细胞浸润。胸部X线双肺透光度减低。各组伤后肺组织TNFα均为阳性表达,HV组最明显。结论速度(20.29±0.03)m/s,压缩幅度20%,撞击质量5.7kg撞击面积3.14cm2致伤家兔胸部后出现急性呼吸窘迫综合症,可作为创伤性ARDS动物模型。     

胸部爆炸伤致肺损伤的机制研究

目的:研究原发和继发因素在胸部爆炸伤后肺损伤中的作用。方法:应用兔胸部爆炸伤模型检测伤后肺功能改变,观察肺损伤伤情,检测BALF中IL-6、IL-8、TNF-α和肺组织NFκBP65和p38MAPKmRNA表达,并进行相关分析。结果:100%的家兔发生肺冲击伤,56.7%碎片伤;胸片示两肺纹理增粗、模糊;伤后PaO2、Pa(A-a)O2、SaO2明显下降,肺含水量增加;IL-6、IL-8和TNF-α含量明显升高(P<0.05或P<0.01);肺组织NFκBP65、p38MAPKmRNA表达阳性。NFκBP65、p38MAPKmRNA表达与PaO2、Pa(A-a)O2、IL-6、TNFα水平正相关(P<0.05)。结论:胸部爆炸伤时冲击波和高能碎片引起肺原发损伤,继发因素肺组织p38 MAPK、NFκB P65和IL-6、IL-8和TNFα加重肺功能损害。     

内皮祖细胞和去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣膜的研究

目的将内皮祖细胞(EPCs)诱导分化为内皮细胞后种植在去细胞猪主动脉瓣膜(APV)上,以期为组织工程瓣膜(TEHV)的研制提供一个新的思路。方法采用去垢剂联合胰蛋白酶法去除猪主动脉瓣膜细胞。采用密度梯度离心法从羊骨髓中分离出EPCs,并诱导分化后,免疫组织化学染色鉴定。将诱导分化得到内皮细胞种植到APV上。采用光镜和电镜检测猪主动脉瓣膜的去细胞效果。对内皮细胞在APV上的生长效果进行观察。结果猪主动脉瓣内的细胞完全去除。EPCs经定向诱导后,具有表达CD-31,CD-34,von Willebrand因子等内皮细胞特征。诱导分化后的EPCs可以在APV表面黏附生长,并且表达CD-31和yon Willebrand因子。结论EPCs可以定向诱导分化为内皮细胞并可以在APV上种植生长。     

婴幼儿主动脉缩窄合并心脏畸形的外科治疗

目前，外科手术仍是治疗主动脉缩窄的最佳选择，尤其对于合并其他心血管畸形的婴幼儿。1998年5月至2006年11月，我们共收治29例年龄〈36个月的主动脉缩窄合并其他心脏畸形的病儿，现总结报道如下。     

腹膜透析治疗心脏手术后肾功能衰竭

目的 总结心脏手术后发生急性肾功能衰竭患者用腹膜透析治疗的经验。方法 ll例患者于心脏手术后发生急性肾功能衰竭，少尿、无尿平均持续14．3小时时开始用腹膜透析治疗。结果 腹膜透析有效率72．7％，死亡3例，死亡率27．3％。尿素氮(BUN)、肺泡动脉氧分压差(A—aD02)腹膜透析后明显低于腹膜透析前(P＜0．05)，血钾离子浓度和二氧化碳结合力(C02—CP)迅速恢复正常，肌酐(Cr)、中心静脉压(CVP)呈下降趋势，平均动脉压(MAP)、心排血量(CO)和心脏指数(CI)呈升高趋势。结论 腹膜透析可改善心脏手术后肾功能衰竭患者的呼吸循环功能，是一种安全、有效的治疗措施，及时应用腹膜透析对预后有积极的影响。     

管理信息系统中图文数据的存储和显示

目的：研究管理信息系统中图片和文本混合在一起的数据及其存储和显示方式，为信息系统的管理和使用带来方便。方法：以Access2003为后台数据库，Delphi7为开发平台，利用RXRichEdit控件将图文数据存储在数据库中。结果：解决了图文数据在数据库存储的问题．实现了图文数据的输入、存储和显示等主要功能。结论：RXRichEdit控件可以简化图文数据的存储与显示，不但方便了用户操作，而且提高了信息管理系统性能。