巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因的原核表达比较

目的：探讨巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因hmGFP的生物学特性及应用的可能性。方法：构建了hmGFP的两个原核表达载体并进行诱导表达。结果：低温下hmGFP获得了功能性表达而发光。深入比较了重组巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因hmGFP在两个表达体系中的表达差异，其中pETTFRX-hmGFP的重组蛋白表达水平和可溶性均比pET21b—hmGFP高。结论：对pETTFRX—hmGFP的表达条件进行了优化，为下一步hmGFP成熟重组蛋白的纯化及其荧光波谱分析奠定了良好基础。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

重组海葵溶细胞素及平颏海蛇磷脂酶A2对血管外膜成纤维细胞增殖的影响

目的 观察重组海葵溶细胞素(rSrc)及平颏海蛇磷脂酶A₂(rPLA₂)对成纤维细胞增殖的影响。方法 体外培养成纤维细胞,应用不同浓度的rSrc和rPLA₂分别进行作用并设立对照进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定成纤维细胞的增殖状态。结果 各组细胞增殖率分别为:对照组0.840±0.061、rSrc 100 μg/ml组0.263±0.044、rSrc 10 μg/ml组0.418±0.054、rSrc 1 μg/ml组0.605±0.063、rSrc 100 ng/ml组0.772±0.054、rSrc 10 ng/ml组0.906±0.072、rPLA₂ 100 μg/ml组0.498±0.076、rPLA₂ 10 μg/ml组0.937±0.112、rPLA₂ 1 μg/ml组0.978±0.145。统计分析显示,低至1 μg/ml的rSrc仍能明显抑制大鼠成纤维细胞的增殖(P<0.01),并呈现剂量依赖性(P<0.05)。rPLA₂ 100 μg/ml组与对照组相比细胞增殖率有显著差异(P<0.05);rPLA₂ 10 μg/ml和rPLA₂ 1 μg/ml组与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。结论 rSrc和rPLA₂分别对血管外膜成纤维细胞增殖有一定的抑制作用。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑索蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因，连接PGEM-T载体，测序确认，定向克隆入pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因，构建表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE分析，出现特异性蛋白质条带，并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达．表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖，为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

赤魟亲环素A的融合表达、纯化及活性特征

目的探讨赤鱼亲环素A基因(dsCypA)的生物学功能.方法构建硫氧还蛋白基因融合表达体系PETTRx-dsCypA,低温诱导表达的融合蛋白dsCypA-TRX,利用金属螯合亲和层析纯化后,经蛋白酶切割和进一步纯化,得到高纯度成熟重组dsCypA,测定其酶活性.结果重组dsCypA具有与人CypA相近的肽基脯氨酸顺反异构酶活性,这在鱼类CypA中是首次报道.结论 dsCypA的功能克隆可能部分地解释赤魟工尾刺中药应用的分子生物学机制,也为从比较生物学的角度,深入开展CypA基因的结构与功能关系研究奠定了基础.     

重组腺病毒载体介导外源基因转移至痉挛脑血管的研究

目的　探讨蛛网膜下腔出血后腺病毒载体介导外源基因转移至痉挛颅内血管的可行性。方法　采用“枕大池 2次注血法”建立兔迟发性脑血管痉挛模型 ,在第 2次注血同时枕大池内注入 2 5 0 μl复制缺陷型重组腺病毒载体 (Ad5CMV5GFP) ,滴度为 2 .5× 10 9pfu/ml,2、4d后 (初次注血第 5天和 7天 )行荧光显微镜、免疫组织化学和RT PCR检测颅内血管和血管周围组织中外源基因GFP(绿色荧光蛋白 )的表达情况。结果　 2d时在基底动脉外膜可见GFP表达 ,4d时消失 ,而中膜和内膜未见GFP表达 ;2～ 4d时颅底软脑膜细胞、小血管外膜和平滑肌层可见GFP表达。结论　经脑池内注入重组腺病毒载体可以将外源基因转移至痉挛脑血管和软脑膜中 ,为迟发性脑血管痉挛的防治提供方法     

血管生成抑制因子人内皮抑素基因的克隆与原核表达

目的：构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体。方法：实验于2004—02／12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成，表达质粒由中山大学医药分子实验室保存，肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏。用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因，连接PGEN-T载体，在16℃下以进行16h连接反应，转化大肠杆菌DH5α，对所获克隆扩大培养，提取质粒经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切鉴定。将带有插人片段的重组质粒命名为PGEN-Tendo。对其阳性克隆扩大培养，大量提取质粒，以T7，SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认。将PGEN-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切后定向连接，转化人大肠杆菌DH5α，聚合酶链反应鉴定阳性克隆，命名为pBV220-endo。将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养，经42℃热诱导4h后收菌，对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。离心收集菌体并超声破碎，将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果：反转录-聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573bp。用EeoRⅠ，BamHⅠ双酶切，10g／L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552bp的内皮抑素片段和约为3000bp的PGEN-T载体片段，说明内皮抑素已成功构建在PGEN-T载体上。经全自动正、反向测序，Genbank分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因，该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A，但编码的氨基酸都是精氨酸，经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，出现特异性蛋白质条带，大小与人内皮抑素蛋白大小相符合。非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达，表达量为14．5％。结论：克隆的552bp的内皮抑素基因，经与GenBank中人胶原ⅩⅧcDNA中内皮抑素基因比较，基因序列基本一致，说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达，为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础。     

重组海蛇碱性磷脂酶A_2的抗肿瘤活性与相对酶活性的关系

背景与目的:蛇毒磷脂酶A2(snakevenomphospholipaseA2,SVPLA2)是一类分子量为14ku左右的蛋白家族,除了酶活性,该蛋白还具有多种药理活性。迄今,陆地蛇PLA2的结构与功能关系特别是其酶活性与药理活性的关系已被广泛研究,但对海蛇PLA2的研究则较少。本文旨在研究重组平颏海蛇碱性磷脂酶A2(recombinantseasnakebasicphospholipaseA2,rSSBPLA2)及其突变体(rN48和rK49)体内外抗肿瘤作用,并探讨酶活性相关位点对抑瘤作用的影响。方法:对酶活性相关位点48、49位氨基酸进行His→Asn和Asp→Lys的定点突变,用MTT法检测rSSBPLA2及其突变体rN48和rK49对人原髓白血病细胞HL-60、人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH、人胃癌细胞MGC-803和人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用;用小鼠S180移植瘤和艾氏腹水癌(EAC)模型对rSSBPLA2进行抗肿瘤作用观察;并检测突变体对小鼠移植瘤的抗瘤活性。结果:与rSSBPLA2相比较,突变体rN48和rK49的相对酶活力分别为0和5%。rSSBPLA2对HL-60细胞、SK-N-SH细胞和MGC-803细胞的IC50值分别为(45.28±0.09)μg/ml、(57.07±0.12)μg/ml和(69.34±0.35)μg/ml,对HepG2细胞生长没有抑制作用;而rN48和rK49对以上细胞均无抑制作用。rSSBPLA2对小鼠S180移植瘤具有明显的抑制作用,按2mg/kg(qd×10)、2mg/kg(q2d×5)、4mg/kg(qd×1)、4mg/kg(q5d×2)实验给药,其抑瘤率分别为50.8%、43.2%、38.2%、55.5%;rSSBPLA2按4mg/kg(q5d×2)剂量给药时,对EAC抑瘤率为33.5%,与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。而突变体rN48和rK49分别按4mg/kg(q2d×5)和7mg/kg(qd×10)方案进行实验,无明显抗肿瘤作用。结论:rSSBPLA2的抑瘤活性可能与其酶活性密切相关。     

赤魟尾刺cDNA表达文库的构建

目的　以赤尾刺为出发材料,构建以真核表达载体pcDNA 3.0为基础的赤尾刺cDNA表达文库。方法　应用SMART^TM cDNA Library Construction 技术和初步生物信息学分析等方法。结果　通过对亚文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,已获得了56个赤新EST序列,其中已确定的全长cDNA克隆有24个,包括IPL肿瘤抑制因子、亲环素cyclophilin A、硒蛋白selenoprotein W、半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin A、tyrosyl-tRNA synthetase 和 calcineurin 类似物蛋白等。结论　这些基因在赤中绝大多数均为首次发现。赤尾刺cDNA表达文库的成功构建,将有利于对赤尾刺中药应用的分子作用机理的深入研究     

人分泌型内皮抑素质粒的构建及序列测定

目的：旨在获得人内皮抑素(endostatin)分泌型基因片段。方法：合成含信号肽的上游引物，用聚合酶链反应技术克隆人分泌型内皮抑素基因，10g／L琼脂糖凝胶电泳后回收，将其重组入PGEM-T载体，双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列。结果：经Genbank分析证实，所获得的645bp基因片段序列属于信号肽及人内皮抑素功能区段基因，翻译为蛋白质序列正确。结论：本研究为应用内皮抑素基因进行肿瘤的抗血管生成治疗奠定了基础。