自体骨髓来源内皮祖细胞移植对移植静脉桥血管再内皮化及内膜增生的影响

目的:已有实验研究证明,移植骨髓来源内皮祖细胞可以促进球囊损伤后血管内皮的修复及抑制内膜的增生.那么移植骨髓来源内皮祖细胞对自体静脉移植术后静脉血管内皮修复和内膜增生是否起同样的作用?观察自体骨髓来源内皮祖细胞移植对自体静脉移植术后静脉桥血管再内皮化及内膜增生的作用。方法:实验于2007-01/08在北华大学附属医院内科实验室完成。实验室级别:P2级。①实验材料:6～8月龄雄性新西兰大白兔由解放军第二军医大学实验动物中心提供.体质量(2.5±0.5)kg,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法:抽取成年兔骨髓分离制备骨髓单个核细胞,体外扩增法培养出骨髓来源内皮祖细胞.在培养第7天通过Ac-Dil-LDL、FITC-BS-1双染色及流式细胞仪检测CD34、CD133、FIK-1表达进行细胞鉴定,应用DAPI荧光染料体外标记培养7 d的骨髓来源内皮祖细胞、将成年新西兰大白兔23只随机分为细胞移植组(n=13)和对照组(n=10)进行自体左颈外静脉、颈总动脉移植术,在建模后第3天将DAPI标记的骨髓来源内皮祖细胞悬液经耳缘静脉植入细胞移植组动物体内,埘照组植入等量的PBS液③实验评估:细胞移植后4周.观察兔静脉移植段血管性及内膜厚度。结果:23只免均进入结果分析,无脱落:①通过体外扩增法培养的骨髓来源内皮组细胞,培养至7 d可见AC-Dil-LDI及FITC-BS-1双染色阳性细胞并表达CD34、CD133及FIK-1。②在呈绿荧光染色的血管内皮中可见有部分不均匀的散发蓝色荧光(DAPI标记细胞的细胞核)。③细胞移植组兔静脉血管内皮有DAPI标记的细胞.且内膜厚度明显低于对照组(P<0.05)结论:自体骨髓来源的内皮祖细胞移植可以促进损伤部位血管内皮的修复.并抑制内膜的过度增生。     

电针对大鼠海马兴奋性突触后电位长时程增强的作用

背景：海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)与行为学研究相结合，已被广泛用于包括中医药在内的改善学习记忆功能和治疗老年性痴呆的研究。目的：观察电针对麻醉状态下正常和东莨菪碱引起的学习记忆减退模型大鼠海马兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)LTP的作用。设计：随机对照研究。地点和材料：SD大鼠40只，体质量270～310g，单纯随机分成为：对照组、电针组、模型组和模型+电针治疗组，每组10只。干预：引导大鼠海马齿状回颗粒细胞层突触后兴奋性电位群(EPSPs)，强直刺激大脑皮质前穿质区引起海马突触LTP反应；用东莨菪碱制备学习记忆障碍模型；电针(疏密波3～5mA，30min)大椎和双侧肾俞穴；观察电针对正常和模型大鼠海马LTP的影响。主要观察指标：强直刺激前和强直刺激诱发后0，60，120min LTP群发电位信号(PS)，PS的EPSP潜伏期，PS锋值潜伏期，EPSP的斜率，PS锋值和PS锋面积(PSa)。结果：①电针对强直刺激诱发的海马突触LTP效应的作用强于对照组。与对照组比．EPSP潜伏期明显缩短[相对于强直刺激前的变化率对照组与电针组分别为(-7．8&;#177;2．6)％比(-14．4&;#177;7．7)％，差异有显著性意义(t=2．5681，P&;lt;0．05)]；EPSP的斜率增加(t=2．4364，P&;lt;0．05)；PS锋面积增大(t=2．7508～2.9909，P&;lt;0．05)，且维持时间长于对照组。②东莨菪碱可显著抑制强直刺激诱发的海马突触LTP，表现为：EPSP潜伏期和PS锋值潜伏期延长，与对照组比较差异均有非常显著性意义(t=4．5648～5．9965，P均&;lt;0．01)；EPSP的斜率下降，PS锋值和PS锋面积变小。③电针能显着对抗东莨菪碱对海马突触LTP的抑制作用，与模型组比较各参数均有统计学意义。结论：电针对强直刺激引起的海马突触LTP有一定的易化作用，并对东莨菪碱引起的学习记忆障碍有显著的对抗作用。     

大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ,Ⅱ型胶原蛋白的表达:失神经状态下Western blot方法测定

背景：近年来大量的实验及临床观察均证实神经因素对骨折愈合有调节和支配作用。Ⅰ型胶原是促成骨细胞分化和增强成骨细胞黏附能力主要因素，是组成骨构架的基质蛋白；而Ⅱ型胶原由软骨细胞产生。目的：观察失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达的变化规律。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005—05／12在解放军第二军医大学动物实验室及细胞生物教研究室完成。材料：选用3月龄健康雄性SD大鼠40只，采用随机数字表法分为2组，单纯胫骨骨折组与脊髓损伤并胫骨骨折组各20只。方法：单纯胫骨骨折组大鼠于从左胫骨平台前缘插入1根中Φ8min克氏针，制成胫骨骨折模型。脊髓损伤并胫骨骨折组在植备上述模型的基础上，横断切除T30段脊髓约0．3cm，制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型。主要观察指标：分别于伤后1，2，4，5周采用Western blot法检测两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原的蛋白表达。结果：伤后第1周两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原均有表达，脊髓损伤并胫骨骨折组两种胶原的表达程度均高于单纯胫骨骨折组（P〈0．05）：伤后第2周脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原的表达量达到峰值，高于单纯胫骨骨折组（P〈0．05）；伤后第4周单纯胫骨骨折组Ⅰ型胶原表达量达峰值，高于脊髓损伤并胫骨骨折组（P〈0．05），脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原仍有高表达：伤后第5周两组Ⅰ、Ⅱ型胶原表达量均下降。结论：失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ胶原的分泌规律与正常骨折愈合一致，区别在于各时间点尤其是在峰值点上表达量有明显差异。     

士的宁背景下电针对大鼠不同脊髓节段甘氨酸含量的影响

目的:探讨循经感传形成过程中脊髓甘氨酸的作用。方法:将40只健康雄性SD大鼠随机分为5组:空白组、假电针组、士的宁组、电针组、士的宁解溪组。采用柱前衍生-反相高效液相法,观察皮下注射甘氨酸受体拮抗剂士的宁后电针解溪穴,对大鼠不同脊髓节段甘氨酸含量的影响。结果:电针组电针后可显著减少颈犤(2.86±0.68)nmol/g犦、腰段犤(3.88±0.67)nmol/g犦脊髓的甘氨酸含量,与空白组甘氨酸(4.98±1.18),(5.12±0.70)nmol/g比较,差异有非常显著性意义(P<0.01);胸段甘氨酸含量则有增加的趋势,但没有统计学意义(P>0.05)。电针的影响存在与士的宁某些相一致的效应;在士的宁提高脊髓兴奋性的背景下电针解溪穴,可显著减少颈、腰段脊髓甘氨酸的含量(P<0.05～0.01),值得注意的是,在胸段其影响与单纯注射士的宁或电针的效应相反。结论:士的宁背景下电针,可能通过阻断和/或干扰甘氨酸对脊髓的抑制作用而提高脊髓的兴奋性,并且不同的脊髓节段其机制可能不同。     

电针对癫痫大鼠脑组织及肝脏的一氧化氮和一氧化氮合酶含量的影响

目的:探讨电针对癫痫大鼠脑组织和肝组织中一氧化氮,一氧化氮合酶(nitricoxidesyntheses,NOS)的影响,以及电针治疗癫痫的可能机制。方法∶实验于2004-03/10在南京中医药大学第二临床医学院实验室完成。选择SD大鼠40只,随机分成为正常组、模型组、电针组、假针刺组,每组10只。采用比色法测定对癫痫造模大鼠的一氧化氮,NOS和一氧化氮/NOS比值进行随机对照分析性研究。结果∶模型组脑一氧化氮犤(19.76±2.66)μmol/L犦,NOS犤(498.8±94.7)nkat/g犦和一氧化氮/NOS比值(1.38±0.46)明显高于正常组(P<0.05),电针组脑一氧化氮犤(6.04±3.52)μmol/L犦,NOS犤(203.9±102.2)nkat/g犦和一氧化氮/NOS比值(1.00±0.57)明显低于模型组(P<0.05),假针刺组一氧化氮,NOS和一氧化氮/NOS含量不明显变化。肝组织中各项因子变化与脑组织中变化一致。结论∶电针对癫痫大鼠的一氧化氮,NOS和一氧化氮/NOS有显著的抑制调节作用。这可能是电针治疗癫痫临床取得疗效的重要机制之一。     

电针对士的宁诱发大鼠脊髓背角c-fos基因表达的影响

背景大鼠皮下注射士的宁后电针解溪或昆仑穴,是否可诱发出脊髓跨节段的c-fos表达.目的通过电针对士的宁诱发大鼠脊髓背角c-fos基因表达情况,探讨针刺信息传递中脊髓兴奋性的作用.设计完全随机对照研究.单位南京中医药大学江苏省针灸学重点实验室.对象采用健康雄性Wistar大鼠,体质量200～230 g.随机分为空白对照组,假电针组,士的宁组,电针解溪组,士的宁解溪组,电针昆仑组和士的宁昆仑组等7组,每组8只.干预空白对照组不做任何处理;假电针组臀部皮下注射生理盐水(与士的宁等容量,下同)30 min后解溪穴插针不给电刺激;士的宁组臀部皮下注射士的宁(1.0 mg/kg,下同)30 min后解溪穴插针不给电刺激;电针解溪组注射生理盐水30 min后电针解溪穴;士的宁解溪组注射士的宁30 min后电针解溪穴;电针昆仑组注射生理盐水30 min后电针昆仑穴;士的宁昆仑组注射士的宁30 min后电针昆仑穴.主要观察指标各组大鼠不同脊髓节段背角的c-fos表达.结果皮下注射士的宁可在大鼠脊髓L5诱发中等量的c-fos表达,而皮下注射士的宁后电针解溪或昆仑穴,不仅可使脊髓L5的c-fos表达增强,同时在T12和C8节段也可诱发c-fos表达;其标记最密集的区域主要在背角的Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ层亦有少量分布.结论在脊髓兴奋性提高的条件下,针刺信息可能沿脊髓进行跨节段传递.提示脊髓兴奋性的改变可能是影响针刺信息传递的重要基础之一.     

神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响

背景：临床中发现失神经可导致骨折断端骨痂过度生长甚至在肌肉中出现异位骨化 ,这一现象提示神经因素对骨折愈合有影响。 目的：探讨神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-06/2006-03在解放军第二军大学动物实验中心完成。 材料：健康雄性3个月龄SD大鼠120只，体质量250~300 g，随机分为单纯左胫骨骨折组和神经生长因子治疗组，每组60只。注射用神经生长因子由厦门北大之路生物工程有限公司提供。 方法：两组大鼠制备单纯胫骨骨折，神经生长因子治疗组肌注2 000 AU(1.4 g)，1 次/ d,分别注射两侧腓肠肌，连续肌注2周。伤后第4周对2组大鼠骨折断端行断层CT，测量骨折断端最大横截面及计算骨痂灰度值，行生物力学3点折弯试验。 主要观察指标：①骨组织形态计量学、骨密度测定。②骨痂组织形态学的观察。③免疫组化法测定骨痂组织骨钙素的表达。④观察2组大鼠骨痂中成骨细胞的超微结构变化。⑤Western印迹检测Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达。 结果：神经生长因子治疗组3点折弯试验各项生物力学参数均优于单纯左胫骨骨折组(P < 0.05)。形态学及超微结构观察见神经生长因子治疗组骨折愈合优于单纯左胫骨骨折组。神经生长因子治疗组Ⅰ型胶原蛋白表达明显高于单纯左胫骨骨折组(P < 0.05)；而单纯左胫骨骨折组骨痂Ⅱ型胶原蛋白的表达明显高于神经生长因子治疗组(P < 0.05)。 结论：生物力学测试及Ⅰ型胶原蛋白表达和成骨细胞微观结构均说明神经生长因子对骨折断端的骨化有促进作用，其途径有可能在骨痂生长的不同时期通过调节Ⅰ、Ⅱ型胶原的量来调控骨折的愈合。     

电针对Aβ_(25-35)诱导的阿尔茨海默病大鼠模型海马长时程增强的影响

目的:探讨针刺改善阿尔茨海默病(AD)学习记忆能力衰退的机制。方法:将30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组及电针组,每组10只。将10μg Aβ25-35注射于模型组与电针组大鼠的双侧海马齿状回背侧制备AD模型。电针治疗取"大椎""百会""肾俞""涌泉"穴,每次30 min,每日1次,治疗7 d。应用跳台实验和电生理学方法观察电针治疗后AD模型大鼠学习记忆能力和海马突触传递长时程增强(LTP)的变化。结果:与假手术组相比,模型组大鼠跳台错误次数和累计错误时间显著增加(P0.05,P0.01);而电针干预治疗可显著改善AD大鼠跳台实验的错误次数和累计错误时间(P0.05,P0.01)。模型组大鼠的LTP显著衰退(P0.01);电针治疗可显著促进AD大鼠LTP恢复(P0.01)。结论:电针具有改善AD大鼠学习记忆能力的作用,其机制可能与电针恢复海马突触传递LTP有关。     

调督健脑针刺法治疗失眠症的临床研究

目的 观察调督健脑针刺法改善失眠症患者睡眠质量及心身症状的疗效以及二者是否有相关性.方法 41例失眠症患者,采用调督健脑针刺法治疗.治疗前后均采用匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)、九十项症状自评表(SCL-90)评分.结果 除催眠药的使用、恐怖因子外,PSQI、SCL-90各成分及总分治疗前后差异均具有统计学意义(P<0.01).SCL-90总积分治疗前后的差值与PSQI总分治疗前后的差值之间的相关系数为.0.34(P<0.05).结论 调督健脑针刺法能显著改善失眠症患者的睡眠质量及心身症状,且心身症状的改善程度与睡眠质量的改善程度呈正相关.     

体外扩增法分离培养兔骨髓来源的血管内皮祖细胞

背景：体外扩增法培养血管内皮祖细胞操作简便、费用低廉是实验中获取内皮祖细胞的主要方法。 目的：拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞，为进一步观察自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础。 设计、时间及地点：开放性实验，于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成。 材料：6~8月龄新西兰大白兔8只，雌雄不拘，体质量 (2.5±0.5) kg，抽取骨髓，密度离心法分离骨髓单个核细胞 方法：将骨髓单个核细胞接种于密度为1×106 cm-2，加入含有血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中体外扩增培养7 d，通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞，显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞，绿色荧光为结合BS-1的细胞，双染色为橙色荧光。免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133，CD34，Flk-1的表达。 主要观察指标：①细胞形态观察。②血管内皮祖细胞的增殖能力。③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果。④血管内皮祖细胞免疫组织化学鉴定结果。⑤血管内皮祖细胞表面标志物流式细胞仪检测结果。 结果：①细胞形态观察：新分离的骨髓单个核细胞呈圆形，培养72 h后可见贴壁细胞呈集落样生长，细胞呈圆形或不规则形，核分裂相明显，至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接，呈梭形的内皮样细胞。②血管内皮祖细胞的增殖能力：培养2~4 d血管内皮祖细胞增殖较快，之后增殖速度减缓，生长曲线呈典型“S”形外观，培养第6，7天血管内皮祖细胞生长再次增快，吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23。③在血管内皮祖细胞的胞质中，出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集，阳性率达95%以上；与凝集素BS-1结合率几乎达100%；两者双染色率达90%以上。④血管内皮祖细胞免疫组织化学及流式细胞仪检测细胞表面标志物CD133，FlK-1，CD34均呈阳性。 结论：体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体。