pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。 目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。 设计：单一样本观察。 单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。 材料：实验于2006—03／2007—06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2．0～2．5kg。 方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24h在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。 结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24h后，在倒置荧光显微镜488am蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。 结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用

背景:转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用。目的:探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法:分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响。结果与结论:慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106μg/L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%(P<0.05)。提示,C57BL/6mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应。     

Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷.胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应.目的:观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18-20 g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供.Lipofectamine~(TM)2000脂质体为Invitrogen产品.方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行Xhol和BamHI双酶切,用于转染.取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine~(TM)2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48 h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达.结果:质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5 kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度.流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性.plRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强.结论:脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值.     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达☆○

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。 目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。 设计：单一样本观察。 单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。 材料：实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2.0~2.5 kg。 方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。 主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。 结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后，在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。 结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

医学本科留学生的生物化学实验教学

对来华学习医学的外籍留学生本科教育中,生物化学实验教学具有重要作用。笔者在留学生的生物化学实验带教过程中,发现留学生与带教老师之间最重要的是相互之间的理解与沟通;在课堂上多数的留学生能积极地参与实验操作;留学生们认真对待实验报告,而且实验报告完成得也非常好。在此,对留学生生物化学实验带教的过程中发现的问题和观察到的现象进行总结,以期与其他的参与此类课程的同行们进行探讨和交流,从而提高留学生生物化学实验的教学质量。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景:骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入及表达,在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞.目的:探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达.设计:单一样本观察.单位:大连市干细胞与组织工程研发中心,大连医科大学基础医学院生化室.材料:实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成.新西兰大白耳兔,5月龄,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg.方法:以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因片段,定向克隆至载体pMD19-T,限制性内切酶消化鉴定、基因测序后,构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒.同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定.真核表达质粒经酶切鉴定后,采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞.并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.主要观察指标:表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定.结果:实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因,并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接.经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后,在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察,pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光,未经转染的细胞未见发出绿色荧光,说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞.结论:骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体.     

结核分枝杆菌wbbL蛋白质可溶性表达及鉴定

目的 优化结核分枝杆菌wbbL基因在大肠埃希菌中的表达,获得大量可溶性产物并加以鉴定.方法 不同条件下诱导pET16b-wbbL质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达;建立外源重组蛋白质与分子伴侣在大肠埃希菌中的共表达体系,优化其表达条件;超声破碎诱导表达的大肠埃希菌,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物;免疫蛋白印迹(Western blotting)法对重组蛋白质进行鉴定.结果 共表达体系优化表达的蛋白质主要以可溶性形式存在,经0.5 g/L L-阿拉伯糖30℃诱导5 h、0.5 mmol/L异丙酸-D-硫代半乳糖苷30℃诱导2 h时,可溶性目的 蛋白的产量最多,占细胞蛋白总量的55.6%,且所表达的蛋白质为wbbL基因产物.结论 在大肠埃希菌中成功表达出大量可溶性结核分枝杆菌wbbL蛋白质,为研究其酶促反应动力学特征以及建立完善的筛选抗结核药物的酶反应体系提供了基础.     

壳聚糖的降解及其研究进展

壳聚糖对机体的免疫增强作用及抗肿瘤活性越来越引起人们的重视。高脱乙酰度、高分子量的壳聚糖粉剂已推向保健市场。甲壳素脱乙酰后得到的壳聚糖分子量通常在几十万上百万，虽然能溶于包括醋酸、稀盐酸、乳酸等多种稀酸溶液中，但不能溶于水，在开发应用上存在一定不利条件。     

人胰岛素原基因在体外培养的NIH 3T3细胞中的基因转移和表达的研究

研究人胰岛素原基因在体外培养的小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３细胞系的基因转移和表达情况,进而为１型糖尿病的基因治疗提供实验依据。方法采用脂质体转染法分别将未携带外源基因的反转录病毒载体ｐＬＮＣＸ和携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子－人胰岛素原基因的重组反转录病毒载体ＰＮ－ＰＥＰＣＫ－ＩＮＳ转染到体外培养的ＮＩＨ３Ｔ３细胞中,转染后７２小时,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞克隆并培养至２４天,提取细胞的染色体     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。 目的：观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。 设计、时间及地点：单一样本观察的细胞基因工程实验，于2006-03/2007-04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：5月龄新西兰大白耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。 方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。 结果：成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因，基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上，构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞，24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。 结论：pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中，说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。