肿瘤微环境中外泌体在肿瘤发生发展中作用及机制

外泌体(exosomes)是直径在30~100 nm,内含RNA、脂质和蛋白质的纳米级囊泡,来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,与细胞膜融合后释放到胞外,是肿瘤微环境中细胞间通讯和遗传物质的重要载体。肿瘤在发生、发展过程中可通过外泌体与肿瘤微环境中的免疫细胞、内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞之间相互作用从而促进肿瘤的进展,其携带蛋白质、脂质和核酸等内容物释放到细胞外随着体液运输改变肿瘤微环境、促进肿瘤细胞增殖、加快血管形成及促进癌症发展;肿瘤微环境是由肿瘤细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及细胞外基质等共同构成的局部稳态环境,在癌症的发生、复发、转移和化疗耐药等过程中发挥重要的作用。本综述着重讨论外泌体的生物学特性及对肿瘤微环境的影响,为研究及诊断治疗肿瘤提供新的思路。     

利多卡因对金黄色葡萄球菌外毒素TSST-1刺激的特应性皮炎患者外周血单一核细胞的影响

目的 探讨利多卡因对金黄色葡萄球菌外毒素激活特应性皮炎患者单一核细胞的影响.方法 抽取6例特应性皮炎患者外周血,常规分离培养单一核细胞.以金黄色葡萄球菌外毒素刺激共孵育,同时加入不同浓度的利多卡因.3H-TdR掺入法检测单一核细胞增殖,酶联免疫吸附法(ELISA)检测Th1和Th2细胞因子的释放.Western印迹法检测利多卡因对与中毒性休克综合征毒素1(TSST-1)刺激的特应性皮炎患者单一核细胞共孵育的HaCaT细胞中间丝相关蛋白的表达.结果 TSST-1(100 μg/L)显著刺激了特应性皮炎患者单一核细胞的增殖(SI=75±2.12,P＜0.05),并刺激α肿瘤坏死因子、γ干扰素、白细胞介素(IL)2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-13细胞因子的释放(均P＜0.05).CCK-8检测结果显示,与空白对照组相比,100 μmol/L利多卡因显著抑制了TSST-1刺激的特应性皮炎患者单一核细胞的增殖(SI=58±3.14,P＜0.05),亦显著抑制了TSST-1刺激的特应性皮炎患者外周血IL-4、IL-5、IL-13、α肿瘤坏死因子以及γ干扰素的释放,差异有统计学意义(均P＜ 0.05).Western印迹法结果显示,100 μmol/L利多卡因阻断了HaCaT细胞中间丝相关蛋白表达的下调,差异有统计学意义(P＜ 0.01).结论 利多卡因对TSST-1刺激的特应性皮炎患者单一核细胞的激活具有明显的抑制作用.     

多重PCR法检测结核分枝杆菌耐药基因研究

目的:建立多重PCR法快速检测结核分枝杆菌耐药基因.方法:采用多重聚合酶链反应(PCR) 同时扩增46株结核分枝杆菌临床分离株、48株北京标准菌株、40例耐药及40例非耐药的结核分枝杆菌临床分离菌株的inhA、katG、rpoB、IS1081等基因并采用测序的方法进行验证.结果:所有耐药样本基因(包括利福平、异烟肼耐药...     

TrKA-siRNA抑制乳腺癌细胞系MCF-7 NF-κB的表达并促细胞凋亡

目的 探讨TrKA基因表达的变化对NF-κBp65核蛋白的表达和细胞凋亡的影响。方法 构建TrKA特异小干扰RNA（siRNA）表达载体,重组体经测序鉴定正确后转染乳腺癌MCF-7细胞。G418(geneticin)筛选稳定表达TrKA siRNA干扰细胞株,命名为TrKA-siRNA。荧光实时定量RT-PCR,Western blot和免疫组化法检测TrKA基因的表达,Western blot检测NF-κBp65核蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果 成功构建 TrKA-siRNA 表达载体,TrKA mRNA和蛋白水平分别下调74.7%和80.5%（P<0.05）。阳性对照 GAPDH 基因表达水平下降85.0%（p<0.05）;NGF作用2 h后,MCF-7组细胞NF-κBp65核蛋白表达明显增加,而TrKA-siRNA组细胞NF-κBp65核蛋白改变不显著。与MCF-7组相比,TrKA- siRNA组细胞凋亡明显增加（p<0.05）,NGF对其凋亡无促进作用。结论 有效阻断TrKA基因的表达能抑制NF-κB抗凋亡途径的活化,从而增加了乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。此作用可能不依赖于外源性的NGF。     

长链非编码RNA GAS5对人乳腺癌细胞株增殖和侵袭能力的影响

目的:探讨长链非编码RNA GAS5对人乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移生物学活性的影响.方法:qRT-PCR方法检测3株乳腺癌细胞株SKBR-3、MDA-MB-231及MCF-7中LncRNA GAS5的表达;LncRNA GAS5干扰片段和过表达载体分别转染LncRNA GAS5高表达以及低表达的乳腺癌细胞株,qRT-PCR方法检测转染后LncRNA GAS5的表达;磺酰罗丹明B染色法检测细胞的增殖能力;Transwell和划痕实验检测细胞的侵袭及迁移能力.结果:LncRNA GAS5在乳腺癌SKBR-3细胞中表达量最低,MCF-7细胞中表达量最高(P＜0.01);SKBR-3以及MCF-7细胞分别转染LncRNA GAS5过表达载体和干扰片段后,SKBR-3细胞LncRNA GAS5表达量增高,MCF-7表达量降低(P＜0.01);下调LncRNA GAS5的表达,细胞的增殖能力升高,侵袭及迁移能力增强(P＜0.01);过表达LncRNA GAS5之后,细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力减弱(P＜0.01).结论:LncRNAGAS5是涉及到乳腺癌发展的一个新型的分子,有可能成为乳腺癌治疗的潜在靶点.     

人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3．1-NT-3。方法：采用PCR技术，扩增编码神经营养素-3基因，克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和BamHI位点。结果：重组真核表达载体pcDNA3．1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中，碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。结论：构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列，并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因，可能具有转染多种哺乳类细胞通用性，可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。     

TrkAsiRNA表达载体构建及对TrkA基因表达的抑制

目的　构建具有特异阻断TrkA基因功能的siRNA表达系统 ,为前列腺癌基因治疗提供新的方法。方法　根据Genbank提供的TrkA基因mRNA序列 ,应用设计软件设计特异性的短链寡核苷酸 ,化学合成后经退火形成双链DNA片段 ,克隆到pSlincerTM2 1 U6载体中 ,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切和序列测定对重组体进行鉴定 ,最后将构建的表达载体转染前列腺癌细胞株 ,观察对TrkA基因表达的影响。结果　酶切和序列测定表明 ,成功构建了siRNA表达载体 ,能够抑制细胞内TrkA基因表达。结论　本研究构建的siRNA表达载体 ,具有阻断TrkA基因的表达的功能 ,为前列腺癌基因治疗提供新的有效的方法。