原位RT-PCR法检测柯萨奇B病毒RNA的实验研究

目的建立定位检测细胞或组织中柯萨奇Ｂ病毒ＲＮＡ的原位ＲＴ－ＰＣＲ方法（直接法）。方法对柯萨奇Ｂ病毒（１～６型）感染ＨｅＬａ细胞,经核酸酶（ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ）处理后的病毒感染ＨｅＬａ细胞以及非感染的ＨｅＬａ细胞进行原位ＲＴ－ＰＣＲ检测。结果经扩增后,病毒感染的ＨｅＬａ细胞呈蓝黑阳性信号;并且这种阳性信号经ＲＮａｓｅＡ作用而消失,却不受ＤＮａｓｅ作用的影响;而非感染的ＨｅＬａ细胞则不着色。结论原位ＲＴ－ＰＣＲ法可特异地检测柯萨奇Ｂ病毒感染ＨｅＬａ细胞中的病毒ＲＮＡ,是一种特异和敏感的定位检测方法,可应用于研究该病毒的持续性感染及其与克山病等相关疾病的关系     

原位RT—PCR法定位检测柯萨奇B病毒RNA

目的：用定位检测细胞或组织中柯萨奇B病RNA的原位RT－PCR方法（直接法）。方法：对柯萨奇B病毒（1－6型）感染HeLa细胞,经核酸酶（DNase和RNase)处理后的病毒感染HeLa细胞以及非感染的HeLa细胞进行RT－PCR和原位RT－PCR检测。结果：经原位RT－PCR扩增后,病毒感染的HeLa细胞叶蓝黑阳性信号,并且这种阳性信号经RNaseA作用而消失,即不受DNase作用的影响;而非感染的HeLa细胞则不着色,其显示的结果与RT－PCR的结果一致。结论：原位RT－PCR法可特异地检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中的病毒RNA,是一种特异和敏感的定位检测方法,可应用于研究该病毒的持续性感染及其与克山病等相关疾病的关系。     

人类乳头瘤病毒16例晚期基因L1大肠杆菌可诱导表达系统的构建

本研究采用亚克隆和序列修饰策略建立了编码人类乳头瘤病毒１６例主要结构蛋白Ｌ１基因的大肠杆菌可诱导表达质粒ｐＴｒｃ９９Ａｍ－ＨＰＶ１６－Ｌ１。通过限制性内切除分析验证了ｐＴｒｃ９９Ａｍ－ＨＰＶ１６－Ｌ１的结构。     

中国妇女宫颈癌组织中HPV16L_1基因的克隆与测序

中国妇女宫颈癌组织中ＨＰＶ１６Ｌ１基因的克隆与测序谷鸿喜钟照华凌虹郭淑元张凤民郭彩玲人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）基因功能区主要由早期基因区（Ｅ区）、晚期基因区（Ｌ区）和调节区组成。Ｌ区包括Ｌ１和Ｌ２。Ｌ１基因编码病毒的主要衣壳蛋白，该蛋白能剌激机体产生保护...     

HPV18 L1基因重组DNA构建及其免疫小鼠体内特异抗体的测定

目的：人类乳头瘤病毒１８型（ＬＰＶ１８）感染与宫颈癌的发生高度相关。其晚期基因Ｌ１编码的Ｌ１结构蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原。利用ＨＰＶ Ｌ１基因重组质粒进行ＤＮＡ疫苗的初步免疫学实验研究。方法：从ＨＰＶ１８－ｐＢＲ３２２质粒中扩增ＨＰＶ１８ Ｌ１基因,测序证明扩增片段的可靠性,构建了两个真核表达重组质粒ＨＰＶ１８ Ｌ１－ｐｃＤＮＡ３和ＨＰＶ１８Ｌ１－ｐｃＥＰ４。将提纯的质粒ＤＮＡ直接免疫     

柯萨奇B3病毒中国分离株VP1基因序列分析

目的：分析柯节奇B3病毒（CVB3）中国分离株编码主要中和抗原的VP1基因序列。方法：用逆转录PCR技术扩增CVB3中国分离株的VP1基因，通过TA克隆法构建pCR2.1-VP1并进行核苷酸序列的测定分析。结果：测序发现CVB3中国分离株与CVB3 Nancy株VP1基因均编码293个氨基酸，二者存在59个核苷酸差异，其中10处影响到氨基酸的编码，其余均为同义变异，结论：CVB3中国分离株与Nancy株VP1基因序列存在一定的差异，该差异对免疫学性状的影响有待进一步鉴定。     

Construction of Human Papillomavirus Type 16 Late Gene L1 Inducible Expression System for E. coli

本研究采用亚克隆和序列修饰策略建立了编码人类乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）主要结构蛋白Ｌ１基因的大肠杆菌可诱导表达质粒ｐＴｒｃ９９ＡｍＨＰＶ１６Ｌ１。通过限制性内切酶分析验证了ｐＴｒｃ９９ＡｍＨＰＶ１６Ｌ１的结构。初步表达显示携带ｐＴｒｃ９９ＡｍＨＰＶ１６Ｌ１的ＪＭ１０５在ＩＰＴＧ的诱导下可合成大小约５５ｋＤ的蛋白质,与预期结果一致     

人乳头瘤病毒16型L1基因重组表达质粒的构建及在E.Coli宿主中的表达与鉴定

构建ｐＧＥＸ４Ｔ－１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组表达系统。为进一步研制基因工程疫苗奠定基础,采用ＰＣＲ方法扩增ＨＰＶ１６中国分离株Ｌ１外源基因片段,ｐＧＥＸ４Ｔ－１为表达载体。构建ｐＥＧＸ４Ｔ－１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组表达系统,在大肠杆菌宿主ＢＬ（２１）中,经ＩＰＴＧ诱导,表达融合蛋白ＧＳＴ－Ｌ１,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ进行鉴定结果表明,成功构建ｐＥＧＸ４Ｔ－１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组     

中国妇女宫颈癌组织中HPV_(16)L_1晚期基因克隆及重组质粒的构建

本实验采用ＰＣＲ方法，以中国妇女宫颈癌组织ＤＮＡ为模板扩增出了３株ＨＰＶ１６Ｌ１晚期基因ＤＮＡ片段，扩增参数为９４℃１ｍｉｎ，５５℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，共３５个循环。将扩增产物ＨＰＶ１６Ｌ１ＤＮＡ片段与克隆载体ｐＣＲ２．１连接构建了ＨＰＶ１６Ｌ１－ｐＣＲ２．１重组质粒。经酶切ＨＰＶ１６Ｌ１－ｐＣＲ２．１重组质粒回收ＨＰＶ１６Ｌ１基因片段，将其与表达载体ｐＰＩＣ３．５连接，构建了ＨＰＶ１６Ｌ１－ｐＰＩＣ３．５重组体，并经酶切鉴定得到确认。为进一步对感染型ＨＰＶ１６Ｌ１晚期基因的测序及表达打下了基础。     

大鼠胎脑组织冻存与同种异体移植

目的 探讨冻存大鼠胎脑细胞体外培养的活性及其移植后的存活情况。方法 对经冷冻保存1－24周的WK大鼠胎脑细胞进行体外培养,观察其存活情况,并将保存24h后培养14d的胎脑细胞行脑内定位移植。结果 冻存1－24周的胎脑组织其活细胞率在90％以上,复苏后培养14d的胎离细胞活性最强;胎脑细胞移植后可在受者体内存活至少30d以上。结论 冷冻保存后培养的胎脑细胞级够存活,并可用于移植。