C末端缺失NR2B亚单位表达载体的构建及其在NMDA受体装配研究中的应用

目的：研究NMDA受体NR2B亚单位细胞内C末端，在NR1—1a／NR2B亚型NMDA受体装配和表面表达中的作用。方法：构建C末端不同缺失和GFP标记的NR2B亚单位表达载体，单独转染或与NR1亚单位共转染到HEK293细胞，用抗GFP多克隆抗体和Cy3荧光素交联的二抗作活细胞表面受体染色。结果：成功构建了8个C末端不同缺失的GFP—NR2B表达质粒(GFP—NR2B△1～△8)。将GFP—NR1—1a，GFP—NR2B及GFP—NR2B△1～△8分别单独转染HEK293细胞，不能获得迭细胞膜表面的表达。而将这些质粒分别与NR1—1a共转染293细胞，发现GFP—NR2B及C末端部分缺失的GFP—NR2B△1～△6，均能与NR1—1a一起表达于细胞膜表面，而仅留有PDZ结合基序的GFP—NR2B△7和C末端全长缺失的GFP—NR2B△8，则不能与NR1—1a一起表达于细胞膜表面。结论：NR1—1a与NR2B的共表达和装配，是形成NR1—1a／NR2B亚型NMDA受体并表达于细胞表面的必要条件。NR2B与NR1—1a装配时，NR2B对NR1—1a C1盒中内质网滞留基序的遮蔽和阻滞作用，并不依赖于NR2BC末端某一特定的区域，相反可能仅要求有一定长度的NR2BC末端。     

三种人类高致病性冠状病毒的增殖和传播机制研究进展

严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是目前已知的三种人类高致病性冠状病毒,由非结构蛋白、结构蛋白、附属蛋白和核糖核酸组成。病毒粒子通过冠状病毒的刺突糖蛋白（S蛋白）识别宿主受体,以膜融合方式进入宿主细胞,通过大型复制转录复合体在宿主细胞内复制,并通过干扰和抑制宿主的免疫应答来促进增殖。人类高致病性冠状病毒的宿主是人和脊椎动物,病毒粒子通过飞沫、接触、气溶胶等途径感染肺部细胞,也可能通过消化道、尿液、眼部等其他途径传播。本文基于现有研究结果讨论人类高致病性冠状病毒的增殖和传播机制,以期为阻断其传播和致病提供依据。     

NMDA受体NR2A亚单位C末端突变体在HEK293细胞的共表达研究

目的：研究N—甲基—D—天冬氨酸(NMDA)受体NR2A亚单位的细胞内羧基端在受体装配和表面表达中的作用。方法：构建N末端GFP标记、C末端不同区域缺失的NR2A亚单位表达载体GFP—NR2A△C1～GFP—NR2A△C5，其C末端缺失区依次分别为897L—1017S、1024D—1142P、1149D—1347G、1354S—1464V和897L—1464V。将它们单独转染或与NR1亚单位共转染到HEK293细胞，用抗GFP多克隆抗体和Cy3荧光素交联的二抗作活细胞表面受体染色。结果：成功构建了5个C末端不同区域缺失的GFP—NR2A表达质粒GFP—NR2A△C1～GFP—NR2A△C5。将这些载体分别单独转染HEK293细胞，均不能获得达细胞膜表面表达。而将这些质粒分别与NR1—1a共转染HEK293细胞，发现它们均能与NR1—1a表达于细胞膜表面。结论：NR1—1a与NR2A的共表达是形成NR1—1a／NR2A亚型NMDA受体并获得细胞表面表达的必要条件。NR2AC末端897L下游并未找到直接与NR1—1a C1盒中内质网滞留基序相互作用的某一特定区域，也不含有决定NR2A亚单位本身细胞内滞留的区域。     

NR2A亚单位C末端的部分缺失对 NMDA受体功能和表达的影响

目的研究NMDA受体NR2A亚单位羧基末端（以下简称为C末端）不同部位缺失对该受体表面表达和功能的影响。方法以GFP-NR2A为起始质粒构建了4个依次缺失部分c末端的GFP标记的NR2A亚单位表达载体：NR2A-ΔC1（缺失897L至1017S）、NR2A-ΔC2（缺失1024D至1142P）、NR2A-ΔC3（缺失1149D至1347G）及NR2A-ΔC4（缺失1354S至1464V）;通过活细胞免疫化学染色分析这些载体与NR1-1a亚单位共转染后在HEK293细胞和海马神经元的表面表达,并通过电生理检测转染HEK293细胞NMDA受体的功能。结果当NR2A-ΔC1、NR2A-ΔC2、NR2AΔC3、NR2A-ΔC4分别与NR1-1a共转染HEK293细胞时,均可获得细胞膜表面表达,其表面染色阳性的细胞在绿色荧光蛋白细胞中的百分比与共转染NR1-1a／GFP-NR2A时的百分比相比均无显著性降低;并且NR1-1a／NR2A-ΔC2或NR1-1a／NR2A-ΔC4转染的HEK293细胞均能记录到谷氨酸诱发的NMDA受体通道电流。在海马神经元中,当转染NR2A-ΔC1、NR2A-ΔC2或NR2A-ΔC3时,单位长度树突表面表达的受体簇数量均显著低于转染GFP-NR2A的神经元,而转染NR2A-ΔC4的树突表面表达的受体簇数量却无显著性降低。结论在HEK293细胞中,C末端部分缺失的NR2A亚单位不影响含NR2A亚单位的NMDA受体在膜表面表达;而在海马神经元中,含NR2A的NMDA受体的表面表达数量受NR2AC末端的调控。