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目的:优化人可溶性TRAIL蛋白生产菌发酵及纯化条件,从而提高TRAIL的产量及活性。方法①探索6种不同培养液、培养液pH值、异丙基硫代半乳糖苷( IPTG)诱导浓度及时间,选择最佳发酵条件;②联合镍离子亲和层析及超滤法纯化人可溶性TRAIL蛋白。结果①人可溶性TRAIL的最佳发酵条件为pH7.4的YPD培养液,所用IPTG的最佳浓度为0.2 mmol/L,最佳诱导时间为6 h;②经镍离子亲和层析和超滤联合作用可得纯度极高的蛋白。结论成功完成了人可溶性TRAIL发酵及纯化条件的优化,为今后大量提取TRAIL蛋白奠定了基础。 相似文献
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目的探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因(HBX)促肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL)蛋白诱导人肝癌细胞Huh7凋亡的机制。方法应用脂质体转染法将pcDNA3.1-HBX、pcDNA3.1分别转染Huh7细胞,建立稳定表达HBX的细胞模型Huh7-HBX和空载体对照细胞模型Huh7-3.1;运用TRAIL蛋白分别作用Huh7-HBX细胞、Huh7-3.1及Huh7细胞后,采用CCK8、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况;Western blot检测死亡受体4(deathreceptor 4,DR4)和死亡受体5(death receptor 5,DR5)的表达情况;分光光度法检测细胞caspase8和caspase3活性。结果 RT-PCR及Western blot证实成功构建细胞株Huh7-HBX;CCK8和流式细胞术检测结果均显示Huh7-HBX细胞的凋亡率明显高于Huh7-3.1及Huh7(P<0.05);Western blot显示Huh7-HBX细胞的DR4、DR5的表达量明显高于Huh7-3.1及Huh7细胞(P<0.05);caspase活性检测结果显示,Huh7-HBX细胞caspase8及caspase3的活性明显高于Huh7-3.1及Huh7(P<0.05)。结论 HBX能够通过上调Huh-7细胞表面死亡受体DR4、DR5的表达,进而促进TRAIL蛋白诱导的细胞凋亡,为进一步研究HBX的促凋亡机制提供实验依据。 相似文献
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正肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种选择性累及上下运动神经元的神经系统变性疾病,是运动神经元病的最常见类型。它是以进行性的肌肉无力为特点的致死性疾病,多为中老年起病,主要表现为:首发症状为手指运动不灵活和力弱,随后大、小际肌和蚯蚓肌等手部小肌肉萎缩,渐渐 相似文献
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目的建立高效表达可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白的原核表达载体,获得高生物学活性的TRAIL蛋白。方法取健康人外周血提取总RNA,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pET30a中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。重组载体转化感受态细胞BL21,优化蛋白表达条件;亲和层析法纯化重组蛋白;SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot鉴定。重组蛋白与TRAIL蛋白标准品分别作用Huh-7细胞,CCK8、流式细胞术检测蛋白生物学作用。结果 DNA测序结果证实成功构建重组质粒pET30a/TRAIL,SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot显示pET30a/TRAIL诱导的为可溶性的His-rTRAIL。CCK8、流式细胞术检测结果显示,与TRAIL蛋白标准品相比,His-rTRAIL对Huh-7细胞具有良好的促凋亡作用。结论成功构建高效表达可溶性TRAIL蛋白的原核表达载体pET30a/TRAIL,表达的可溶性蛋白His-rTRAIL具有高度的生物学作用,为肿瘤的生物学治疗提供新的实验依据。 相似文献
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目的探讨缺氧诱导因子(HIF)1α对肝癌细胞HepG2干细胞特性及表阿霉素敏感性的影响。方法以肝癌细胞为研究对象,肝癌细胞HepG2脂质体转染过表达HIF-1α的质粒作为实验组,转染pcDNA3.1空质粒作为对照组,单独HepG2细胞为HepG2组。实时荧光定量PCR检测HIF-1αmRNA表达,Western Blot检测HIF-1α蛋白表达;流式细胞术检测细胞表面CD133表达。不同浓度表阿霉素(0、6.25、12.5、25、50μmol/L)作用3组细胞24 h,MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测表阿霉素(50μmol/L)处理后细胞凋亡情况。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用t检验。结果相较于HepG2组及对照组,实验组HIF-1αmRNA的表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P值均<0.001);Western Blot结果显示实验组HIF-1α蛋白高表达。HepG2组、对照组和实验组细胞的CD133比例分别为0.040%±0.003%、0.030%±0.010%、20.110%±0.600%,实验组的CD133阳性率显著高于HepG2组和对照组(P值均<0.001)。表阿霉素浓度为25、50μmol/L时,HepG2组和对照组的细胞活性明显受到抑制,显著低于实验组(P值均<0.05)。50μmol/L表阿霉素作用48 h后,实验组的细胞凋亡率(67.9%±2.5%)较HepG2组(93.6%±1.5%)和对照组(93.0%±1.2%)明显降低(P值均<0.001)。结论过表达HIF-1α的质粒成功转染至HepG2细胞,HIF-1α可提高肝癌细胞干细胞比例使其对表阿霉素耐药。 相似文献
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目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合水飞蓟素(Sili)对人肝癌Huh7细胞凋亡的影响。方法 CCK8法检测细胞增殖抑制;分光光度法检测细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性;Western blot检测细胞表面死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)的表达。结果 Sili与TRAIL联合作用Huh7细胞后,联合用药组与对照组及单独用药组相比,Huh7细胞的增殖率明显下降;caspase-3、caspase-8、caspase-9的相对活性明显提高。Sili作用Huh7细胞后能明显提高DR4、DR5蛋白表达。结论 Sili可通过上调死亡受体DR4、DR5表达而促进TRAIL诱导的Huh7细胞凋亡,为肝细胞癌的临床治疗提供了新的思路和方法。 相似文献
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