昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

睾丸内注射pEGFP-N1体内转染精子并在山羊早期胚胎成功表达

目的考察自制低叶酸饲料对叶酸复合物分子靶向肿瘤程度的影响。方法采用放射性核素标记方法制备[^99mTc]DTPA-叶酸。两组不同叶酸含量饲料喂养的荷SGC-7901瘤裸鼠行尾静脉注射[^99mTc]DTPA-叶酸，检测4h后组织分布。结果与普通饲料组相比，低叶酸饲料组中[^99mTc]DTPA-叶酸在肿瘤组织分布量显著提高，相对增加量达34．5％，其他非靶组织的分布则明显减少。结论喂食自制低叶酸饲料能显著提高DTPA-叶酸对肿瘤组织的靶向程度，为叶酸复合物分子的肿瘤靶向诊断和治疗时选用低叶酸饲料提供了依据。     

通过双原核显微注射提高转基因小鼠研制效率的实验研究

目的建立高效的转基因小鼠制备技术,为开展遗传工程动物模型研究奠定技术基础。方法通过向小鼠受精卵原核中注入不同浓度的DNA分子,筛选最适注射用DNA浓度;将K14/hCTLA4-Ig基因表达载体分子通过显微注射分别导入小鼠受精卵雌、雄原核,并设立单原核注射对照组;利用输卵管腹壶部穿刺移植法将注射后的小鼠受精卵移植于同期发情的受体母鼠;利用PCR对出生的转基因首建小鼠进行筛选。结果最适DNA分子浓度为10ng/μl;在单、双原核注射组胚胎2细胞卵裂率分别为52.3%(132/253)和45.0%(108/240),差异有显著性(P<0.05);注射胚胎移植后体内存活率分别为18.1%(24/132)和16.7%(18/108),差异无显著性;转基因首建小鼠阳性率分别为3/24和5/18,转基因阳性小鼠占总注射胚胎的比例为1.2%(3/253)和2.08%(5/240),差异有极显著性(P<0.01)。结论尽管双原核注射对胚胎的2细胞卵裂率有一定影响,但通过双原核注射可有效提高转基因小鼠的制备效率。     

不同山羊个体的精子结合和内化外源DNA能力的差异性研究

目的探讨不同山羊个体的精子结合和内化外源DNA能力差异性，以及精子内化能力对制备转基因山羊胚胎阳性率的影响。方法用地高辛标记与检测试剂盒检测12只山羊的精子分别结合、内化质粒DNApEGFP-N1的效率；体外受精实验检测胚胎阳性率与精子内化pEGFP-N1能力的关系。结果不同山羊个体的精子结合和内化pEGFP-N1的效率存在差异，内化效率最高为53．7％，最低为3．1％；3号公羊的精子体外转染外源基因后行体外受精，所得的2～8细胞胚胎表达外源基因pEGFP-N1的阳性率最高，7、8、10、11号公羊的精子体外转染外源基因后行体外受精，所得的2～8细胞胚胎均未表达GFP蛋白。结论不同山羊个体的精子自发结合、内化外源DNA的能力存在差异；不同山羊个体的精子体外转染外源基因后行体外受精，所得的2～8细胞胚胎表达外源基因的比例不同。     

提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻方法

目的筛选一种既提高精子转染外源DNA效率,又保持解冻后精子活力的山羊精液冷冻—解冻方法。方法应用正交设计L9(34),因素分别为稀释液种类、稀释比例、降温时间和解冻液,每个因素选择3个水平,检测和比较解冻后精子转染外源DNA效率和精子活力。结果所选冷冻—解冻各因素对精液转染效率影响不显著[F(8,18)=1.032,P=0.449];平衡时间对冷冻—解冻活力影响极显著[F(2,24)=9.972,P=0.001],平衡1h极显著小于平衡2 h和4 h的精液活力(P=0.003,P=0.000),以平衡4 h最好。用筛选的冷冻—解冻方法处理精液,解冻后精子的活力极明显降低(P=0.002);生存指数降低,GOT释放量增加,菌落数减少,与鲜精相比差异显著(P=0.018;P=0.016;P=0.018);精子畸形率增加,顶体完整率降低,与鲜精相比差异不显著(P=0.494;P=0.084)。结论优化了提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻—解冻方法。     

双荧光探针检测冷冻对精子质膜完整性的影响

目的:检测精液冷冻对山羊精子质膜完整性的影响。方法:用假阴道法采集3只公山羊精液,经冷冻-解冻处理后,检测精子畸形率和顶体完整率,用碘化丙锭结合羟化荧光素双荧光探针标记,检测和比较精液冷冻对山羊精子质膜完整性的影响。结果:冷冻明显降低了精子的活动率[(74.43±13.78)%vs(46.25±2.69)%,P<0.01]和质膜完整率[(64.26±7.03)%vs(6.27±2.90)%,P<0.01];显著降低了顶体完整率[(80.77±10.70)%vs(58.42±18.05)%,P<0.05]。结论:冷冻使精子活动率和顶体完整率降低的同时导致精子质膜严重破损。