植入前遗传学筛查用于几种适应症的效率初探

目的探讨植入前遗传学筛查(PGS)用于染色体异常、反复种植失败和反复自然流产患者的效率。方法回顾性研究2015年1月到2016年3月在我中心行PGS治疗,共328个取卵周期和随后进行的263个冻胚移植周期,根据其适应症分为男方染色体异常(A组)、女方染色体异常(B组)、反复种植失败(C组)和反复自然流产(D组),分析4组患者的体外受精-胚胎发育情况、胚胎单核苷酸多态性(SNP)检测分析结果和临床结局。结果 4组患者成熟卵母细胞(MII)率、受精率、卵裂率、D3有效胚胎率均无统计学差异(P0.05);获卵数在A组(12.93±5.73)、B组(13.17±6.65)显著高于C组(10.48±6.07)、D组(10.76±5.47),D组可进行PGS活检的胚胎数与D3有效胚胎数的比率(57.2%)显著高于A组(51.3%)、B组(48.4%)和C组(50.0%)(P均0.05);正常核型胚胎比率C组(71.6%)、D组(58.7%)显著高于A组(39.0%)、B组(33.5%),而无可移植正常核型胚胎的周期率D组(13.5%)显著低于A组(31.3%)、B组(33.3%)、C组(29.1%)(P均0.05);4组患者的妊娠率和流产率均无统计学差异(P0.05)。结论三种适应症的患者实施PGS均能达到满意的临床妊娠率;夫妇染色体异常的患者最终获得正常核型胚胎的几率较低,但是有效避免了高流产率的风险;反复自然流产的患者经PGS筛选后胚胎移植可将流产率控制在较低水平(3.4%)。     

人卵母细胞形态学指标预测受精和胚胎发育潜能

目的:探讨卵母细胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)周期中人卵母细胞形态学测量的指标与受精和胚胎发育潜能之间的关系。方法:利用OCTAX Eye-ware software系统在对卵母细胞行ICSI前,逐一采集卵母细胞图像,测量透明带厚度、卵母细胞大小、极体位置的卵间隙大小和极体形态(完整或破碎),将ICSI后的卵母细胞和受精后的胚胎进行单孔培养,记录每个卵母细胞的受精情况、胚胎发育情况。对卵母细胞的形态数据与受精情况、胚胎发育情况进行逐步多元因素Logistic回归分析。结果:共测量卵母细胞436枚,受精率84.9%(370/436),胚胎可用率60.8%(225/370),卵母细胞形态学指标中,透明带厚度、极体位置的卵间隙大小和卵母细胞受精与否有关,受精卵较未受精卵有较厚的透明带[(18.0±2.3)μm vs.(16.9±2.7)μm]和较大的卵间隙[(14.4±3.3)μm vs.(13.2±3.9)μm];而卵母细胞的大小和极体形态均与取卵后72 h的胚胎发育质量有关,发育为可用胚胎的卵母细胞较发育为废用胚胎者有较大的直径[(116.6±3.7)μm vs.(114.7±3.6)μm]和较高的极体完整率(86.2%vs.66.7%)。结论:人卵母细胞形态学测量的指标可预示卵子受精和胚胎发育的潜能。     

激光辅助孵化对冻融胚胎移植临床结局的影响

目的 探讨激光削薄法辅助孵化(AH)对冷冻第3天胚胎移植结局的影响.方法 选取行第3天冷冻胚胎移植患者的1 024周期,其中964个周期行常规的第3天冻存胚胎移植(非AH组),60个周期于第3天冻存胚胎复苏后,用激光将1/4透明带削薄2/3后移植(AH组);分析两组的种植率、临床妊娠率、多胎率、活产率、流产率及生化妊娠率.结果 两组的种植率、临床妊娠率、多胎率、活产率、流产率及生化妊娠率分别为43.2％和24.2％、58.3％和43.2％、45.7％和26.9％、78.4％和77.7％、21.6％和22.3％、6.7％和4.4％;其中AH组的种植率、临床妊娠率及多胎率与非AH组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);而活产率、流产率及生化妊娠率高于非AH组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 采用激光削薄方法进行AH可以提高冷冻复苏第3天胚胎移植后的种植率及临床妊娠率,而对活产率无明显影响.     

冷冻前和复苏后胚胎质量对临床结局的影响

目的将复苏后胚胎按冷冻前是否含有优胚和/或是否同冻存时分组,比较他们的妊娠结局,探讨是冷冻前的胚胎质量还是复苏后胚胎是否同冻存时,对妊娠结局的影响更大。方法本中心2008.01-2010.12期间促排获得胚胎并冻存,患者年龄<35岁,复苏并移植2枚胚胎的683周期,共分四组:A组同冻存时,≥1枚优胚;B组同冻存时,0枚优胚;C组≥1枚有球溶解可用胚,≥1枚冻前优胚;D组≥1枚有球溶解可用胚,0枚冻前优胚。分析各组妊娠率、多胎率的差异。结果总复苏率94.08%,冻前优胚复苏率98.01%(395/403),高于冻前非优胚复苏率92.56%(971/1049),P<0.01。A组比B组、A比D组、A+C组比B+D组妊娠率高(P<0.01),C组比B组妊娠率高(P<0.05),多胎率没有统计学差异;A组比C组、B组比D组、A+B组比C+D组的妊娠率、多胎率都没有统计学差异。结论冷冻前胚胎质量比复苏后胚胎是否同冻存时对妊娠结局有更大影响。     

人卵泡液脂肪酸谱评估卵母细胞发育潜能的初步研究

目的:分析体外受精(IVF)患者单卵泡液脂肪酸谱表达差异与卵母细胞发育潜能的相关性。方法:利用气相色谱分析技术检测卵泡液脂肪酸谱,以第3日胚胎碎片评分(EFS)及胚胎细胞数目(ECN)为卵母细胞发育结局的评价指标,行相关性分析。结果:单卵泡液中普遍存在6种脂肪酸:十一烷酸、肉蔻豆酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸。Spearman分析显示油酸与EFS呈正相关(r=0.357,P=0.014),各种脂肪酸与ECN无明显相关性。Logistic回归进一步分析显示油酸浓度为EFS阳性预测因子(OR=1.035,95%CI 1.007~1.064)。结论:人卵泡液油酸含量在一定程度上可预测卵母细胞发育潜能。     

人成熟卵母细胞玻璃化冷冻技术的临床应用

目的探讨玻璃化冷冻技术应用于人成熟卵母细胞冷冻保存的临床效果。方法使用开放式载体cryotop进行人成熟卵母细胞的玻璃化冻存,对10例患者的冷冻卵子复苏后进行卵母细胞浆内单精子（ICSI）注射后行胚胎移植,观察复苏卵母细胞受精、卵裂、胚胎发育及临床妊娠情况。结果 10例患者共86枚玻璃化冻存的成熟卵母细胞复苏后77枚存活,69枚正常受精,获得65枚胚胎,共移植17枚胚胎,3例患者获临床妊娠,其中2例双胎妊娠。结论玻璃化冷冻技术是有效地保存人成熟卵母细胞的方法,有一定的临床应用价值。     

人卵泡液氨基酸谱影响卵母细胞发育潜能的初步研究

目的分析体外受精（IVF）患者单卵泡液氨基酸谱含量与卵母细胞发育潜能的相关性。方法利用高效液相色谱（HPLC）分析技术检测49份IVF患者优势卵泡的单卵泡液氨基酸谱,并追踪所获卵母细胞发育结局。依据取卵后第三天（D3）胚胎评分分为可用胚胎组（A组）与不可用胚胎组（B组）,比较两组氨基酸谱含量差异。结果①两组患者的年龄、不孕年限、体重指数、基础性激素及用药支数均无统计学差异（P〉0.05）;②A组患者的取卵数、受精率及卵裂率略高于B组,但无统计学意义（P〉0.05）;A组患者的可用胚胎数及可用胚胎率（7.41±4.64、65.15%）显著高于B组（5.00±3.38、49.75%）（P〈0.05）;③A组卵泡液中丙氨酸（Ala）含量（335.86±70.79μmol/ml）明显高于B组（293.56±67.30μmol/ml）（P〈0.05）,其余氨基酸含量无统计学差异（P〉0.05）。④利用ROC曲线确定卵泡液中Ala含量预测可用胚胎形成的临界值为325.4μmol/ml,灵敏度63%,特异度81.8%。结论优势卵泡的发育可在一定程度上反映IVF患者的总体情况,卵泡液中Ala含量可作为预测卵母细胞受精后早期胚胎发育的参考指标之一。     

染色体平衡易位携带者生育策略的伦理思考

通过论述平衡异位的相关知识,对其携带者的疾病特点作了分析。在此基础上,指出了平衡易位携带者在遗传咨询中面临以下几种生育策略时的伦理困境：尝试自然怀孕,自然流产风险高,接受产前诊断可能面临终止妊娠的决定;接受胚胎植入前遗传学诊断,其标本取样和诊断技术仍然存在某些局限性和缺陷,费用相对昂贵;使用捐献的配子,可能面临保密问题和与中国传统观念相悖的困境;领养孩子,同样面临保密问题和与中国传统观念相悖的窘境。因此,遗传咨询医师在对平衡易位携带者咨询过程中应遵循有利于患者、知情同意、保护后代、社会公益、保密、严防商业化、伦理监督等原则。     

成体兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的打靶研究

目的构建兔HPRT基因打靶载体。方法在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HGPR乃基因BAC克隆（LBNL1—304M19）的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HGPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-HGPRT质粒。然后基于pKS-HGPRT和pEGFP—C1-SD1211质粒,构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）及新霉素（neo）筛选标记基因的打靶载体pKS-HGPRT-GFP—neo。结果将线性化的打靶载体通过脂质体转染的方法整合到成体兔成纤维细胞基因组中,利用G418及6-TG进行细胞克隆的抗药物筛选,共得到抗性细胞克隆20个。对细胞克隆进行PCR及测序初步鉴定,获得8个发生同源重组的细胞克隆,还需利用Southern blotting做进一步验证。结论成功快速地构建了且PR丁基因敲除型打靶载体,为下一步进行体细胞核移植制备HGPRT基因敲除转基因克隆兔奠定基础。     

利用PCR产物快速构建免HPRT基因无启动子打靶载体

目的探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础。方法首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT）基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS—rHPRT质粒。然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50bp HPRT基因同源序列的IRES-eGFPCre—Frt／Neo／Frt同源重组片段,最终构建HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。结果PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功。结论成功快速地构建了HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究。