CD70在肝细胞癌转移侵袭中作用的研究

【立论依据及设计思路】 CD70属于肿瘤坏死因子超家族成员,为II型跨膜蛋白,与淋巴细胞上CD27结合后发挥作用。其在包括肾癌在内的多种肿瘤中表达异常,与免疫逃离有关。但CD70在肝细胞癌中的表达及其作用目前尚不清楚,本课题组在前期实验中意外地获得了具有很强迁移侵袭能力的肝癌细胞,而在这种细胞中CD70表达显著下降,随后我们又分析了40例巴塞罗那(BCLC)不同分级肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织中CD70的表达,发现肿瘤出现转移后,CD70的表达明显下调,说明肝癌发生转移时CD70的表达确实出现改变。因此本实验旨在研究CD70表达变化与肝癌细胞转移侵袭间的关系,为肝癌病程提供新的潜在的转移标志物. 【实验内容】 (1)选择HepG2、Huh7、Hep3B和BEL-7402不同肝癌细胞系,利用流式细胞分选技术,分选CD70阳性和CD70阴性的细胞进行培养。(2)运用相差显微镜、扫描电镜及透射电镜观察CD70表达情况不同的细胞形态;应用MTT的方法检测不同细胞的细胞活力;利用transwell实验检测不同的细胞迁移和侵袭能力;最后根据实验结果,查询与迁移有关的蛋白质并利用蛋白质印迹的方法进行检测。(3)分别采用裸鼠尾静脉注射观察肺部转移瘤和脾脏注射观察肝转移瘤的方法,评价CD70表达变化与肿瘤转移及注射后裸鼠生存率的关系;通过皮下注射检测不同细胞的成瘤性并保留照片和组织,进行免疫组化以及蛋白检测。(4)选择新鲜人肝癌组织,用流式细胞技术对这些组织进行CD70表达的检测并分选,再将分选好的新鲜人肝癌细胞异体移植到裸鼠体内以检测其细胞特性是否与体外培养的细胞一致。 【材料】 HepG2、Huh7、Hep3B、及BEL-7402细胞系,流式分选仪,CD70的流式抗体BD Pharmingen 555834,BD Pharmingen 555835,裸鼠,新鲜人肝癌组织 【可行性】 前期工作已证实CD70在肝癌细胞转移后表达下调,提示CD70可能参与肝癌的转移;能熟练操作课题中所需的方法;所属实验室为“肝脏保护与再生调节北京市重点实验室”,与北京佑安医院具有合作关系,能获得新鲜人肝癌组织。 【创新性】 首次发现CD70在肝癌转移过程中表达下调,同时本课题首次提出CD70表达下调可能促进肝癌转移。     

五年制基础医学专业荧光双染法分析细胞凋亡与细胞坏死的实验设计

实验根据五年制基础医学专业中"细胞生物学研究方法与实验技术"教学要求,结合学生已学习的"细胞凋亡与细胞坏死"理论知识、细胞染色的基本实验操作以及在科研工作中的实践进行设计,旨在通过综合性实验培养学生的分析问题、解决问题的科学素养。     

几种不同提取线粒体的方法对线粒体含量及活性的影响

目的比较几种不同的提取线粒体的方法对线粒体蛋白浓度及活性的影响。方法采用蔗糖密度梯度离心法、普利莱试剂盒提取方法和Pierce线粒体提取试剂盒方法分别提取线粒体,测定提取得到的线粒体蛋白浓度、污染情况和活性。结果同样数量的细胞采用普利莱法提取得到的线粒体蛋白浓度高于其他2种方法所提取的线粒体蛋白浓度(P<0.05);采用Westernblotting的方法测定提取的线粒体发现采用普利莱法提取得到的线粒体中胞质蛋白污染较其他2种方法提取得到的线粒体少,线粒体纯度高;测定线粒体中细胞色素C和ATP含量后发现同样采用普利莱法提取得到的线粒体活性最高。结论普利莱法提取线粒体的方法优于蔗糖密度梯度离心法和Pierce线粒体提取试剂盒方法。     

应用改良PCR法构建高GC含量启动子多位点定点突变载体

目的利用StrataGene公司的QuickChangeTM定点突变试剂盒对高GC含量的人肝刺激因子启动子进行多位点定点突变。方法采用含有多位点突变的引物扩增启动子片段,通过加入不同浓度的DMSO,降低高GC含量模板及引物的解链温度,利用乙醇沉淀提高酶切产物的浓度。结果经测序鉴定成功构建5个含有不同突变位点的hHSS启动子突变载体。结论这种改良的PCR方法提高了对高GC含量启动子进行扩增的效率,具有快速、简便、经济、成功率高的特点,是值得推广的多位点定点突变载体构建方法。     

利用甲胎蛋白启动子活力筛选人胚胎肝脏前体细胞

目的 利用甲胎蛋白启动子活力筛选人胚肝脏前体细胞克隆。 方法 经聚合酶链反应(PCR)扩增及酶切后连接,将甲胎蛋白启动子片段构建于pGL3载体中并测序鉴定,将其与pRL-TK质粒共转染到HepG2、A549和HeLa细胞中,通过相对荧光素酶活力分析甲胎蛋白启动子活力的特异性。采用克隆化培养法获得人胚胎肝脏细胞克隆,检测各克隆的甲胎蛋白启动子活力,并应用间接免疫荧光染色方法检测甲胎蛋白表达情况。 结果 经PCR、酶切分析及DNA序列测定证实pGL3-AFP质粒克隆成功。将其与pRL-TK质粒共转染到表达甲胎蛋白的HepG2细胞和不表达甲胎蛋白的A549、HeLa细胞中,仅在表达甲胎蛋白的HepG2细胞中检测到了较高的甲胎蛋白启动子活力,胚胎肝脏细胞中也检测到了甲胎蛋白启动子活力,表明其中含有表达甲胎蛋白的细胞。利用克隆培养法获得5个胚胎肝脏细胞克隆,将其分别共转染pGL3-AFP和pRL-TK质粒,发现其中1个克隆的甲胎蛋白启动子活力与HepG2细胞接近,且免疫荧光染色结果显示,该克隆细胞甲胎蛋白阳性率为(99.1±0.6)%,表明此克隆为肝脏前体细胞克隆。 结论 利用甲胎蛋白启动子活力结合克隆培养法可以获得肝脏前体细胞克隆。     

肝刺激因子表达下调通过ERK促进肝癌细胞转移的研究

【目的】 肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)能促进肝细胞增殖、抑制肝细胞凋亡,是细胞内重要的存活因子。本课题组前期研究发现多种促癌因素可下调肝癌细胞中HSS的表达,其表达水平的降低可以促进肝癌细胞发生转移侵袭,但相关机制尚不明了。研究表明细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肝癌转移,因此本研究旨在阐明HSS表达降低与EMT的关系并探究其中的分子机制。 【方法】 利用实验室已经构建好的稳定低表达HSS的HepG2细胞(shRNA)和稳定高表达HSS的HepG2细胞(HSS)作为研究对象,首先应用蛋白质印迹方法检测不同细胞的上皮细胞分子标志物(如E-cadherin和ZO-1)和间质细胞分子标志物(例如vimentin、fibronectin)表达的变化,确定HSS表达改变与EMT的关系;选择在EMT中发挥重要作用的激酶磷酸化抗体,利用蛋白质印迹的方法,筛选参与HSS表达下调诱导EMT发生的激酶,并应用特定激酶抑制剂,通过Transwell转移和侵袭实验,检测细胞迁移侵袭能力的改变,进一步确定候选激酶的作用;最后运用脾注射肝转移实验分析HSS表达下降与裸鼠生存率的关系。 【结果】 蛋白质印迹结果显示shRNA细胞的间质细胞分子标志物表达明显增高,上皮细胞分子标志物表达明显降低,说明HSS表达降低后肝癌细胞发生EMT。AKT和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在EMT的发生过程中具有重要作用,蛋白质印迹结果显示shRNA细胞中AKT磷酸化水平没有明显改变,但ERK的磷酸化水平明显增高;使用不同浓度的ERK抑制剂PD98059后进行trans-well迁移和侵袭实验,结果显示shRNA细胞无论迁出小孔还是穿过铺有基质胶的小孔的数目都明显减少,而且随着抑制剂浓度的增加,发生迁移侵袭的细胞数目随之减少,具有剂量依赖性,说明ERK在HSS表达降低诱导的EMT过程中具有关键的作用。脾注射shRNA细胞4周后,裸鼠体重明显下降,腹部变黑并明显增大,不足9周全部死亡,而注射HSS细胞后,裸鼠体重下降不明显,10周后才开始出现死亡,说明HSS表达降低后促进细胞的迁移侵袭使裸鼠生存时间明显缩短。 【结论】 肝刺激因子表达降低激活ERK,诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化从而促进肝癌的转移。     

早期反应基因Ier5启动子区辐射敏感的转录因子结合位点研究

目的 探讨辐射诱导早期反应基因5(Ier5)的转录调控机制。方法 运用缺失体构建、定点突变、电泳迁移率实验(EMSA)及染色质免疫共沉淀(ChIP)技术,确定宫颈癌HeLa细胞中Ier5基因启动子区域、转录因子及其结合位点。结果 发现Ier5基因的启动子区可能在缺失体Ier5-8所包含的范围(-408~-238 bp)内。Ier5基因具有2个转录因子,分别为GCF、NFI,其中GCF的结合位点在Ier5基因启动子-388~-382 bp和-274~-270 bp处,NFI的结合位点在Ier5基因启动子-362~-357 bp处。GCF抑制Ier5基因的表达,抑制作用随γ射线吸收剂量的增加而减弱,NFI促进Ier5基因的表达。结论 Ier5基因启动子最可能的区域为-408~-238 bp,该区域存在2个辐射敏感的转录因子GCF和NFI的结合位点。GCF对Ier5基因的顺式作用元件起负调节作用,而NFI起正调节作用。     

CCAAT/增强子结合蛋白α抑制人肝癌细胞内的肝刺激因子表达

目的 探讨CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)对人肝癌细胞内肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)表达的影响及其在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)抑制HSS表达过程中的作用.方法 采用凝胶迁移电泳实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究C/EBPα与HSS启动子的体外相互作用,real-time PCR和Western blotting的方法测定hHSS mRNA和蛋白质表达情况.结果 EMSA实验证实C/EBPα可以与hHSS启动子-343/-330区域内的C/EBPα结合位点结合,对hHSS表达具有负性调节作用,C/EBPα siRNA转染入HepG2细胞后,hHSS mRNA和蛋白质表达均升高.但C/EBPα表达下降并不影响EGF对hHSS表达,而EGF不改变C/EBPα的活性和表达.结论 C/EBPα可通过C/EBP位点抑制hHSS的表达,但不参与EGF对hHSS的转录调节过程.     

二恶英对成骨细胞胰岛素样生长因子家族基因表达的抗雌激素作用

目的 探讨大鼠骨骼发育过程中环境类致畸因子对成骨细胞中胰岛索样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)家族基因表达的抗雌激素作用。方法 应用环境类致畸因子二恶英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo—p—dioxin，TCDD)构建先天性大鼠骨骼发育畸形动物模型；应用雌激素和TCDD分别或联合作用于小鼠头盖骨成骨样(MC-3T3-E1)细胞株；再用逆转录-聚合酶链反应及流式细胞仪定量检测胎鼠头盖骨组织和MC-3T3-E1细胞中IGF—I和胰岛索样生长因子结合蛋白-6(insulin—like growth factor binding protein-6，IGFBP-6)mRNA的表达和细胞增殖率。结果 在5～15μg／kgTCDD浓度下诱导了大鼠骨骼发育畸形，并存在剂量依赖性生物学效应；雌激素增加了胎鼠头盖骨组织及MC-3T3-E1细胞中IGF—ImRNA的表达，提高了MC-3T3-E1细胞的增殖率，但使IGFBP-6mRNA的表达降低；TCDD抑制了雌激素对IGF—I、IGFBP-6基因表达及细胞增殖的调节作用。结论 在高雌激素水平下，TCDD可以诱导大鼠骨骼发育畸形；通过靶基因IGF—I和IGFBP-6，TCDD可发挥拮抗雌激素对成骨细胞的正性调节作用。