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通过RT-PCR方法克隆出人野生型负性共刺激分子B7-H4基因,将目的片段双酶切(EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ)后,与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4-WT并进行鉴定;然后用定点突变法构建B7-H4核定位序列突变体基因,再构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4-NLS-MT;脂质体转染法将重组载体导入786-O细胞,CCK8法研究转基因细胞株的增殖率及对化疗药物5-氟尿嘧啶、阿霉素和顺铂的耐药性。结果显示:B7-H4野生型转基因细胞株相较于空白质粒组,可有效促进786-O细胞增殖,并赋予786-O细胞对3种化疗药物的耐药性。与空白质粒组相比,对5-氟尿嘧啶的耐药倍数为2.06,对阿霉素的耐药倍数为1.81,对顺铂的耐药倍数为1.72。机制研究显示B7-H4野生型可赋予肿瘤细胞抗凋亡作用,1.25 μg/mL 5-氟尿嘧啶引起B7-H4 WT/786-O的细胞的凋亡率是20.2%,而Mock/786-O和B7-H4 NLS/MT/786-O细胞的凋亡率分别是41.1%和35.1%。说明B7-H4可能通过调控细胞凋亡赋予肿瘤细胞多药耐药性。当B7-H4核定位序列被突变后,这些功能都消失,说明B7-H4促肿瘤细胞增殖、赋予其多药耐药性的功能与其核定位序列密切相关。 相似文献
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目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对负性共刺激分子B7-H4细胞定位的调控作用。方法体外培养稳定转染B7-H4/HEK293细胞,采用PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002和/或出核转运抑制剂来普霉素B(LMB)处理细胞之后,免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜检测B7-H4蛋白在B7-H4/HEK293细胞中亚细胞定位的变化;Western blot法检测B7-H4蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核表达水平的变化。结果激光共聚焦显微镜观察结果显示,PI3K抑制剂LY294002作用于B7-H4稳定转染的B7-H4/HEK293细胞后,与空白对照组相比,B7-H4发生核转移,加入出核转运抑制剂LMB后,核转移的程度显著增加;Western blot法结果显示,LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性24 h后,B7-H4在细胞膜和细胞质中的定位均显著降低(P0.05),而细胞核中B7-H4的定位显著增加(P0.05)。结论 PI3K/AKT信号通路可抑制B7-H4的核转移。 相似文献
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