人芽囊原虫感染小鼠肠黏膜IL-17和IL-23的表达及意义

目的观察人芽囊原虫(Blastocystis hominis)感染小鼠肠道组织中白细胞介素17(IL-17)和IL-23的表达情况。方法30只BABL/c小鼠随机分为实验组、免疫抑制剂组和对照组,实验组和免疫抑制剂组小鼠腹腔注射地塞米松2 mg/只,日1次,连续5 d;对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.2 ml/只。实验组每鼠经口感染107个人芽囊原虫,免疫抑制组和对照组每鼠经口灌服0.5 ml生理盐水。感染人芽囊原虫5 d后,剖杀小鼠,分别取十二指肠、空肠、回肠和结肠制作成组织切片,HE染色检查小鼠肠黏膜病变,免疫组化法检测各肠黏膜中IL-17和IL-23的表达水平。结果HE染色显示,肠道黏膜有不同程度炎症改变。IL-17和IL-23在实验组小鼠不同肠黏膜中的表达均显著高于免疫抑制剂组和对照组(P<0.05),而免疫抑制剂组与对照组IL-17和IL-23在小鼠不同肠黏膜中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。IL-17在实验组小鼠十二指肠、空肠、结肠黏膜中的表达水平均显著高于回肠黏膜(P<0.05),IL-23在实验组小鼠十二指肠、空肠黏膜中的表达水平显著高于回肠和结肠黏膜(P<0.05)。结论IL-17和IL-23参与人芽囊原虫感染的免疫反应,且IL-17与IL-23在人芽囊原虫感染的免疫应答过程中有一定的相互调节作用。     

曼氏迭宫绦虫中亮氨酸氨基肽酶基因的生物信息学分析和转录水平检测

目的 检测曼氏迭宫绦虫的3个亮氨酸氨基肽酶亚类(leucine aminopeptidases of Spirometra mansoni,SmLAPs)基因在虫体不同发育阶段的转录水平,为进一步病原诊断研究奠定基础.方法 运用生物信息学相关软件对3个亮氨酸氨基肽酶亚类编码蛋白的氨基酸序列的功能区域、免疫学特征、信号肽和跨膜区预测分析.应用Real time PCR方法检测SmLAPs在曼氏迭宫绦虫的成节、孕节和裂头蚴阶段的转录水平. 结果 对SmLAPs编码氨基酸序列的保守区域进行比对,SmLAPa与SmLAPb、SmLAPc的氨基酸序列一致性均为38％,SmLAPb和SmLAPc的一致性也只有44％.多功能位点分析发现,SmLAPs均含有底物结合位点、锌离子结合位点和多肽结合位点.在B细胞线性表位预测结果显示,SmLAPa有13个、SmLAPb有14个、SmLAPc有13个.T细胞表位预测中,SmLAPa有12个、SmLAPb有13个、SmLAPc有14个.3个SmLAPs亚类序列中均含有一个强烈的信号肽,并且均没有跨膜区域.在虫体各个发育阶段的转录水平检测中,在成节阶段,SmLAPb的转录水平是SmLAPa的1.34倍,SmLAPc的转录水平是SmLAPa的46.53倍.在孕节阶段,SmLAPb的转录水平是SmLAPa的1.96倍,SmLAPc的转录水平是SmLAPa的56.89倍.在裂头蚴阶段,只有SmLAPc有转录,没有检测到SmLAPa和SmLAPb的转录. 结论 在3个SmLAPs亚类基因中,SmLAPc是裂头蚴病更有价值的免疫诊断分子.     

曼氏迭宫绦虫异柠檬酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达及其在裂头蚴阶段的转录水平检测分析北大核心CSCD

目的利用生物信息学方法识别和分析曼氏迭宫绦虫异柠檬酸脱氢酶(SmNAD-IDH)核苷酸序列及生物学特征;克隆该基因并诱导蛋白表达,分析其在裂头蚴阶段的转录水平。方法利用生物信息学在线分析工具对SmNAD-IDH基因的核苷酸序列进行识别,预测分析氨基酸序列的理化性质。分别以曼氏迭宫绦虫裂头蚴cDNA、孕节cDNA和成节cDNA作为模板PCR扩增目的基因,扩增产物与表达载体pET-30a重组后转化至BL21细胞中诱导蛋白表达。利用real time PCR技术分析裂头蚴阶段三羧酸循环中3个关键代谢酶的转录水平。结果BLASTx分析SmNAD-IDH基因全长1095 bp,编码蛋白由356个氨基酸组成。该基因与其他寄生虫同源基因核苷酸序列一致性>70%,与人类同源基因核苷酸序列一致性为51%。该蛋白的理论等电点为6.84,分子质量为40 ku,并且氨基酸序列中无信号肽和跨膜区,为脂溶性稳定的胞内蛋白。SmNAD-IDH在裂头蚴、成节、孕节中均有表达,在裂头蚴阶段三羧酸循环中的关键酶柠檬酸合成酶、酮戊二酸脱氢酶、SmNAD-IDH均有转录,以SmNAD-IDH的转录水平较高。结论成功重组SmNAD-IDH基因并诱导SmNAD-IDH蛋白表达,该蛋白对于曼氏迭宫绦虫,尤其是裂头蚴,是具有潜在研究价值的重要代谢酶。     

曼氏迭宫绦虫annexinB8的生物信息学分析和基因克隆

目的通过生物信息学预测曼氏迭宫绦虫annexinB8(SmannexinB8)的生物学特征,及潜在功能和结构,并且进行基因克隆,为下一步SmannexinB8参与宿主免疫调节研究提供依据。方法通过NCBI的ORF finder工具对SmannexinB8的开放阅读框进行分析.利用ExPASy网站进行蛋白的物理化学参数、信号肽、跨膜螺旋、潜在分子生物学功能的预测,通过NCBI/BLAST。对蛋白保守功能域进行检测。不同物种的annexin序列从NCBI网站获取,并利用Vector NTI suit 8.0和TreeView软件进行分析。利用SWISS-MODEL网站和SPDBV 4.10软件分析SmannexinB8蛋白的三维空间结构。此外。对SmannexinB8基因进行扩增,并克隆到原核表达载体pET-28a(+)。结果 SmannexinB8是一个全长基因,编码347个氨基酸。蛋白由4个典型的annexin重复结构域组成,序列当中没有信号肽,是一个稳定的可溶性蛋白分子。三维空间立体结构分析结果显示SmannexinB8是一个保守的蛋白。SmannexinB8与多房棘球绦虫、口膜壳绦虫、细粒棘球绦虫、华支睾吸虫以及人类的annexin基因的同源性分别是68%,67%。65%,46%和40%。分子进化分析显示SmannexinB8与绦虫属的亲源性最近,而与其他物种,如吸虫、哺乳动物亲源性较远。结论 SmannexinB8可能具有抑制磷脂酶A2的活性,促进细胞融合、参与调节免疫反应和离子通道形成的功能,可能在参与宿主免疫调节中起到关键性的作用。     

人芽囊原虫在IMDM单相培养基中的体外培养效果观察

目的观察IMDM（Iscove＇s Modified Dulbecco＇s Medium）单相培养基对人芽囊原虫（Blastocystis hominis,B.h）的体外培养情况。方法采用IMDM单相培养基对B.h进行体外连续培养,比较不同pH值、血清浓度及接种量等条件下虫体生长繁殖情况及影响因素。结果 B.h在IMDM培养基中最适培养条件为：pH值7.0-8.0;新生牛血清含量大于10%;接种量不小于1×105个原虫/管;青、链霉素1万单位/mL,于37℃条件下厌氧培养,每3-6天转种1次,可以达到长期培养效果。结论 IMDM单相培养基更适合B.h的生长繁殖,可以用于诊断及体外长期培养。     

人芽囊原虫感染小鼠血清中IL-17水平的动态观察

目的 观察小鼠感染人芽囊原虫后血清中白细胞介素17（IL-17）水平的动态变化,从细胞因子的角度来探讨IL-17在人芽囊原虫感染中的意义。方法BABL／C小鼠120只随机分为实验组、免疫抑制剂组、对照组,每组各40只,三组小鼠分别于感染后第2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、10d、12d、14d各取4只,采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-17水平。结果免疫抑制剂组和对照组小鼠血清中IL-17的含量在不同感染时期基本处于稳定水平（P〉0．05）,而感染后不同时期的实验组小鼠血清IL-17水平出现升高,差异有统计学意义（P〈0．05）,其中第4d、5d、6d的表达分别高于免疫抑制剂组和对照组（P〈0．05）,且第5d达到高峰。结论提示了IL-17可能在人芽囊原虫早期感染中发挥了重要作用。     

曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I(SmCaMK I)基因的生物信息学分析与表达鉴定

目的 开展SmCaMK I(曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I)的潜在生物学特征分析和功能研究。方法 利用相关网站和软件对SmCaMK I的同源性核苷酸序列比对分析、保守位点预测、构建分子进化树、编码氨基酸的淋巴细胞表位进行分析预测。此外,SmCaMK I进行扩增,并克隆到表达载体pET-28α(+)中进行蛋白的表达纯化,制备大鼠免疫血清进行虫体免疫组织定位分析。结果 SmCaMK I是一个全长基因,由1 068 bp组成,编码355个氨基酸。SmCaMK I与细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的CaMK I保守功能域的氨基酸序列一致性分别为89%和88%,与人的CaMK I氨基酸序列一致性仅仅只有44%。分子进化树分析中SmCaMK I与绦虫属的亲缘关系最近,与其他物种亲缘性较远。与人类CaMK I相比,淋巴细胞表位具有统计学差异。SmCaMK I能够定位在成虫的睾丸和虫卵,在裂头蚴中大量表达和特异定位于体表。结论 SmCaMK I是参与虫体生长发育繁殖的重要蛋白分子,还可能是一个潜在的疫苗靶标蛋白。     

反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的评价

目的评价用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型的反向斑点杂交(RDB)方法。方法应用RDB检测723例HBV阳性标本的HBV基因型。其中对423例HBV序列测序结果清晰可读的样本进一步使用NCBI在线数据库分析、系统进化法分析其HBV基因型,并与RDB法结果进行比较。将样本HBV序列与所用的探针序列进行比对,以评价单个碱基突变对该方法的影响。结果 RDB法检测的检出率为97.6%。RDB检测结果与NCBI在线数据库分析法的一致性为98.8%;与系统进化分析法一致性为100%。与对应探针有1个碱基差异的HBV A型1例、B型12例、C型46例和D型1例均被成功检出。结论 RDB是一种灵敏、准确、有效,且具有很高临床应用价值的HBV基因型检测方法。单碱基的突变不会影响其对HBV的分型结果。     

曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅰ(SmCaMK Ⅰ)基因的生物信息学分析与表达鉴定

目的 开展SmCaMK Ⅰ(曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅰ)的潜在生物学特征分析和功能研究.方法 利用相关网站和软件对SmCaMK Ⅰ的同源性核苷酸序列比对分析、保守位点预测、构建分子进化树、编码氨基酸的淋巴细胞表位进行分析预测.此外,SmCaMK Ⅰ进行扩增,并克隆到表达载体pET-28α(+)中进行蛋白的表达纯化,制备大鼠免疫血清进行虫体免疫组织定位分析.结果 SmCaMK Ⅰ是一个全长基因,由1 068 bp组成,编码355个氨基酸.SmCaMK Ⅰ与细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的CaMK Ⅰ保守功能域的氨基酸序列一致性分别为89％和88％,与人的CaMK Ⅰ氨基酸序列一致性仅仅只有44 ％.分子进化树分析中SmCaMK Ⅰ与绦虫属的亲缘关系最近,与其他物种亲缘性较远.与人类CaMK Ⅰ相比,淋巴细胞表位具有统计学差异.SmCaMK Ⅰ能够定位在成虫的睾丸和虫卵,在裂头蚴中大量表达和特异定位于体表.结论 SmCaMK Ⅰ是参与虫体生长发育繁殖的重要蛋白分子,还可能是一个潜在的疫苗靶标蛋白.