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1.
背景:原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。目的:验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法:将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。结果与结论:基因转染48h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。  相似文献   
2.
背景:原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。目的:验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法:将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。结果与结论:基因转染48h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。  相似文献   
3.
背景:原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。 目的:验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法:将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。 结果与结论:基因转染48 h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。  相似文献   
4.
目的 研究颈静脉孔及其周围结构的显微解剖学特征,为该区域的手术人路及颅神经的保护提供解剖学基础. 方法 显微镜下模拟经颈静脉入路、远外侧经髁入路、迷路下入路等多种入路的联合,从多个角度逐步解剖颈静脉孔及相关区域,明确该区域重要结构的空间关系.结果 在颅内侧,硬脑膜分隔将颈静脉孔分为岩部、乙状部、颈内静脉部.覆盖于颈内静脉部的硬膜有两个孔,二者均位于两个颈内静脉突之间,一个为舌咽神经道,另一个为迷走神经道.乙状窦,岩下窦,颈静脉球,舌咽神经,迷走神经,副神经,咽升动脉脑膜支,枕动脉和耳蜗导水管一同穿行于孔内. 结论 将颈静脉孔描述为岩部、乙状部、颈内静脉部更有手术意义;通过星点可定位横窦和乙状窦交界部.详尽的解剖学研究可提高本区域手术成功率,有助于保护颅神经,减少不必要的损伤.  相似文献   
5.
目的 优化制备包裹反义寡核苷酸(ASODN)的α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA)纳米粒,观察其C6脑胶质瘤细胞的生长抑制作用.方法 以BCA为载体材料,采用界面聚合法制备包裹ASODN的纳米粒(ASODN in NP),并将其转染至C6脑胶质瘤细胞;倒置显微镜下观察游离ASODN组、ASODN in NP组、吸附ASODN纳米粒组和空白纳米粒组转染C6脑胶质瘤细胞后的细胞生长状态,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化,采用CCK-8法测定ASODN in NP对细胞毒性和细胞增殖的影响.结果 与空白对照组相比,除空白纳米粒组外,其他各组转染后的C6脑胶质瘤细胞形态均发生改变,细胞失去原有的贴壁特性,生长密度降低.生长状态变差,其中以ASODN in NP组最为明显,呈时间依赖性;各组细胞周期均发生变化,表现为G1期细胞比例明显增高,S期细胞比例减少,其中ASODN in NP组最为显著(P<0.05);除空白纳米粒组外,各纳米粒组对细胞增殖的抑制效应随ASODN相对终浓度的增加而增加,呈现浓度依赖性特征,其中ASODN in NP组抑制效应显著优于其他各组(P<0.05).结论 ASODN in NP转染C6脑胶质瘤细胞后能有效抑制细胞增殖及改变细胞周期,对胶质瘤细胞生长有明显抑制作用.  相似文献   
6.
目的 探讨以前期实验所构建的腺病毒骨架质粒pAdEasy为载体,编码神经损伤后轴突生长抑制因子Nogo-A、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)、腱糖蛋白-R(TN-R)和髓磷脂相关糖蛋白(MAG)的重组DNA疫苗的免疫原性. 方法 16只5周龄Lewis大鼠按随机数字表法分为DNA疫苗注射组(Vaccine组)和空质粒注射组(pAdEasy组).Vaccine组大鼠以DNA疫苗经双侧胫骨肌注射免疫,1次/周,共持续8周.每次进行疫苗注射前采血和分离血清,Dot-blot和ELISA法对血清中抗体进行定性和定量检测. 结果 6周后Vaccine组大鼠血清能与GST-TN-R和GST-OMgp融合蛋白产生较强的免疫反应,点杂交反应较明显;pAdEasy组大鼠血清则不能与GST-TN-R和GST-OMgp融合蛋白产生免疫反应.6周后Vaccine组大鼠血清中抗体效价则可以达到1:100万,并保持稳定的水平. 结论 编码轴突生长抑制因子Nogo-A、OMgp、TN-R和MAG的重组DNA疫苗接种大鼠后能够产生特异性的抗体.说明该重组DNA疫苗具有良好的免疫原性.  相似文献   
7.
目的 从胶质瘤组织中分离和培养出肿瘤干细胞,并初步探讨其生长特性. 方法 收集脑胶质瘤手术标本并获取细胞,用含有表皮生长因子(EGF)、白血病细胞抑制因子(LIE)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养液原代培养,再经免疫磁珠分离得到CD133+细胞.并用免疫细胞化学技术检测CD133、NSE和GFAP在细胞中的表达以鉴定CD133+细胞,比较不同恶性级别胶质瘤组织的CD133+细胞生长情况,并用CCK8法比较CD133+和CD133-细胞对替尼泊苷(VM-26)的耐药性. 结果 从胶质瘤组织中成功分选获得CD133+细胞,这些细胞能自我更新,增殖,并分化成NSE+和GFAP+的细胞.恶性度高的胶质瘤组织中CD133+细胞生长速度明显比低级别中的CD133+细胞快,且CD133+细胞在含有VM-26培养基中的存活细胞数显著多于CD133-细胞(P<0.05). 结论 胶质瘤组织中存在肿瘤干细胞,这类细胞具有很强的耐药性,高恶性度胶质瘤组织中的CD133+细胞具有更强的增殖能力.  相似文献   
8.
目的研究白细胞介素6(IL-6)及其受体对体外培养的大鼠骨髓源性神经干细胞增殖的影响及信号转导机制。方法采用密度梯度离心法分离骨髓基质细胞,应用特制的神经干细胞培养基诱导培养6d后收集贴壁细胞传代培养,用AlamarBlue摄入法检测不同浓度的IL-6及IL-6受体对大鼠骨髓源性神经干细胞增殖的影响,Westernblot方法检测不同剂量IL-6对干细胞中STAT3表达的影响。结果IL-6能够促进干细胞的增殖,随着药物剂量的增加,增殖作用明显增加,呈明显剂量依赖性,其中20、100、200ng/mL组均与对照组有显著差异(P<0.01),但2ng/mL与对照组、100ng/mL与200ng/mL组之间无显著差异(P>0.05),20ng/mL与100ng/mL组之间有差异(P<0.05)。IL-6受体可抑制干细胞的增殖,单独应用IL-6受体,100ng/mL、200ng/mL组与对照组均有显著差异(P<0.05)。而IL-6与IL-6受体联合应用可促进干细胞的增殖,但增殖作用比单独应用IL-6组差,两组相比有显著性差异(P<0.05)。随IL-6浓度的增加,干细胞中的STAT3表达增加,20、100、200ng/mL组与对照组相差显著(P<0.01)。结论100ng/mL组的IL-6对骨髓源性神经干细胞有较好的增殖促进作用;IL-6受体可抑制骨髓源性神经干细胞增殖;联合应用IL-6和IL-6受体增殖效果不如单独应用IL-6,提示骨髓源性神经干细胞表面自身具有IL-6受体;IL-6通过增加STAT3表达促进骨髓源性神经干细胞增殖。  相似文献   
9.
目的 探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法及体外培养体系,为下一步的治疗性克隆胚激活及培养实验提供相关参照. 方法 (1)选取具有第一极体的成熟兔卵母细胞随机分组,比较1.2 kV/cm、1.6 kV/cm、2.0 kV/cm场强的电激活及5μg/mL离子霉素(ION)激活对兔卵母细胞孤雌激活效果;(2)激活处理后的卵母细胞,分别在添加0、10、20、40、80 ng/mL白血病抑制因子(LIF)及添加0、1×、2×胰岛素、转铁蛋白、硒化钠复合物(ITS)的M199液中培养,比较孤雌胚胎的卵裂率、8-16细胞胚胎比例、桑囊率以及囊胚细胞总数情况. 结果 (1)不同激活方式对兔卵母细胞的激活效果差异较大.ION处理组存活率高于2.0 kV/cm电激活处理组,差异有统计学意义(P<0.05);而在分裂率、8-16细胞率、桑囊率上,ION处理组高于1.2 kV/cm电激活处理组,差异有统计学意义(P<0.05).(2) 20 ng/mL LIF组桑囊率高于80 ng/mL LIF组,差异有统计学意义(P<0.05).在囊胚细胞总数上,20 ng/mL LIF组高于40 ng/mL LIF和80 ng/mL LIF组,差异有统计学意义(P<0.05).1×ITS组的桑囊率高于2×ITS组,差异有统计学意义(P<0.05).此外,0×ITS组及1×ITS组的囊胚细胞总数分别为166.00枚、147.40枚,多于2×ITS组(78.00枚),差异有统计学意义(P<0.05). 结论 ION处理激活新西兰大白兔卵母细胞能获得较好的分裂率和囊胚率;添加20 ng/mL LIF、1 ×ITS可以促进兔孤雌激活胚胎的后期发育.  相似文献   
10.
目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的人LINGO-1胞外段(hLINGO-1_(aa76-319))融合蛋白,并制备兔源性抗hLINGO-1_(aa76-319)的多克隆抗体(pAb).方法 利用PCR从pCMV-SPORT6获得hLINGO-1_(aa76-319)编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319);将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-hLINGO-1_(aa76-319)融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新两兰大白兔制备多克隆抗血清,Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性.结果 成功构建了pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319)原核表达载体,原核蛋白hLINGO-1_(aa76-319)以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90% 以上的hLINGO-1_(aa76-319)蛋白,蛋白浓度为4600 mg/L,制备的抗hLINGO-1_(aa76-319)多抗效价高达1:1.6×106,Western blotting鉴定其具有良好的特异性.结论 获得高纯度hLINGO-1_(aa76-319)蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究LINGO-1的生物学功能提供实验基础.
Abstract:
Objective To express and purify the fusion protein of extracellular domain of human Ig domain-containing, neurite outgrowth inhibitor (Nogo) receptor-interacting protein-1 (LINGO-1_(aa76-319)) in prokaryotic cells and prepare the rabbit anti-LINGO-1 polyclonal antibody (pAb). Methods The 732 bp DNA sequence of hLINGO-1_(aa76-319), was obtained from pCMV-SPORT6 by PCR and inserted into pET30a (+) plasmid to construct the prokaryotic expression plasmid pET30a(+) -hLINGO-1_(aa76-319) which was subsequently transformed into E.coli. The target fusion protein was expressed with IPTG induction and purified by Ni~(2+)-NTA affinity chromatography column. The antiserum against hLINGO-1_(aa76-319) was obtained from the rabbits immunized with hLINGO-1 _(aa76-319), and the titer of the pAb was determined using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and its specificity identified using Western blotting. Results The prokaryotic expression plasmid pET30a (+)-hLINGO-1_(aa76-319) was constructed successfully. Efficient expression of the target fusion protein was achieved with IPTG induction at the optimal concentration of 0.4 mmol/L and culture temperature at 37 ℃ for 2.5 h. The hLINGO-1_(aa76-319) fusion protein was effectively expressed in E.coli as inclusion bodies, and the soluble protein was obtained through denaturation and refolding procedures, and the purified fusion protein showed a purity above 90%. The titer of the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained by immunizing the rabbits with the purified protein reached l:1.6×10~6, and Western blotting confirmed its good specificity. Conclusion The fusion protein hLINGO-1_(aa76-319) with high purity has been obtained and the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained shows a high titer and good specificity, which provide important experimental basis for further functional investigation of LINGO-1.  相似文献   
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