正常健康儿童抗凝血酶Ⅲ含量及活性测定

抗凝血酶Ⅲ(Antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)是生理性抗凝系统中的主要成分,是凝血酶的重要抑制物,对以丝氨酸为活性中心的凝血因子如Ⅹ_a、Ⅺ_a、Ⅸ_a 等都有抑制效应。自70年代以来,AT-Ⅲ的临床研究有了很大发展。目前认为,在多种小儿疾病中     

从血浆冷沉淀中同时制备因子Ⅷ、纤维结合蛋白和纤维蛋白原方法的建立

目的  建立从血浆冷沉淀中同时制备因子Ⅷ（factor Ⅷ,FⅧ）、纤维结合蛋白（fibronectin,Fn）和纤维蛋白原（fibrinogen,Fg）的方法。  方法  用缓冲液溶解抽提冷沉淀,获得的冷沉淀抽提液通过2次DEAE离子交换层析和1次聚乙二醇沉淀进行分离纯化来同时制备FⅧ、Fn和Fg。采用FⅧ∶C活性测定试剂盒检测制备的FⅧ活性,并计算FⅧ比活和回收率。分别用双向和单向免疫扩散试验对制备的Fn和Fg进行定性和定量检测,并计算回收率。结果   制备的FⅧ的平均活性为16.48 U/ml,平均比活为29.84 U/mg,回收率>60%。制备的Fn和Fg的蛋白纯度均>90%,回收率分别为>80%和>75%。结论  采用建立的方法可从冷沉淀中同时制备FⅧ、Fn和Fg。     

优化的α1-抗胰蛋白酶生物活性测定方法的验证

目的 验证优化的α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin,α1-AT）生物活性测定方法.方法 用发色底物法测定α1-AT活性,以牛胰蛋白酶替换冻干正常人血清来优化先前建立的方法,验证优化方法的准确性、重复性,并观察不同物质对优化方法的影响.结果 优化方法在胰蛋白酶质量浓度为0.01～0.05 g/L时线性关系良好,相关系数＞0.99.优化方法具有良好的准确性和重复性,当采用优化方法测定质量浓度为0.01、0.03、0.05 g/L胰蛋白酶时,胰蛋白酶的回收率分别为99.33％、94.44％和92.67％,变异系数分别为3.79％、1.66％和1.02％.在一定范围内,聚乙二醇、蔗糖、枸橼酸钠、人白蛋白浓度变化对优化方法测定α1-AT生物活性没有影响.结论 以牛胰蛋白酶作为参考标准品的优化α1-AT生物活性测定方法可用于α1-AT制备工艺中的常规质量控制.     

98例急性和慢性白血病患者血浆抗凝血酶Ⅲ含量及活性测定

在对98例各种类型白血病血浆 AT-Ⅲ含量及活性测定结果中,发现白血病组血浆AT-Ⅲ含量比正常对照组显著降低(P<0.05)。其中以急性早幼粒细胞性自血病组,急性单核细胞白血病组及慢性粒细胞性白血病组降低非常显著(均 P<0.001)。初步探讨了产生这些结果的部分原因及其临床意义。     

从各种生物体液中分离抗凝血酶Ⅲ的简单两步法

抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)与肝素之间的相互作用具有高度特异性,并对凝血酶以及活化的因子Ⅸ及Ⅹ等的抑制速度,产生增强的效应。AT与肝素的这种相互作用,使肝素亲和层析法成为分离制备AT的重要方法。但通常商品肝素中具有高亲和力的部分不到1/3,且其中能特异地结合AT的位点仅占2～3％。因而结合在琼脂糖上的肝素总量中,仅极小部分能结合AT,而绝大部分肝素则     

重组人载脂蛋白AⅠ的原核表达及活性检测初探

目的原核表达人载脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ),对其表达进行优化,同时对ApoAⅠ活性检测方法进行初步研究。方法通过构建3种不同的重组质粒来研究以组氨酸(His)6融合蛋白表达、(His)6-pro(前肽)融合蛋白与单目的基因表达之间的差别,其中(His)6-pro-ApoAⅠ质粒中目的基因第3、4、7位密码子进行无义突变。随后采用镍离子柱纯化重组蛋白,间接法测定ApoAⅠ对被内毒素(LPS)攻击的细胞的保护效果来检测其生物活性。结果单目的基因(pET28a-ApoAⅠ)、组氨酸标记的融合蛋白(pET28a-(His)6-ApoAⅠ)以及(His)6-pro(前肽)融合蛋白(pET28a-(His)6-pro-ApoAⅠ)表达量分别为17、40、95mg/L,经镍柱纯化后的重组蛋白经Western blot、分子筛层析以及生物活性检测,表明原核表达的ApoAⅠ为单体蛋白且具有相应的生物学活性。结论原核表达的ApoAⅠ与人血浆提纯的天然ApoAⅠ分子生物性状无明显差异。     

人血浆载脂蛋白AⅠ的纯化

 目的  初探大规模纯化人血浆载脂蛋白AⅠ(apolipoprotein AⅠ,ApoAⅠ）的低成本生产工艺。方法  以人血浆组分Ⅳ为原料,通过等电点沉淀、阴离子层析、低温乙醇沉淀和超滤等步骤纯化ApoAⅠ蛋白,并放大实验室纯化方法来纯化ApoAⅠ。结果  放大的纯化方法生产的ApoAⅠ的得率和纯度分别为59.0%和85.6%,经相关方法验证为人血浆ApoAⅠ。结论  实验室方法放大的纯化工艺可纯化ApoAⅠ。     

人纤维结合蛋白制备方法的建立及人纤维结合蛋白稳定性初探

目的  建立人纤维结合蛋白（fibronectin,Fn）制备方法,研究不同保护剂对Fn稳定性的影响。方法  将经磷酸盐缓冲液抽提溶解的血浆冷沉淀用聚乙二醇沉淀,获得的上清液经离子交换层析制得纯化的Fn。将加入复合保护剂的Fn溶液分别于-20、4和37 ℃存放0、5和14 d,观察保护剂抑制Fn降解的效果。结果  采用建立的方法制备的Fn的纯度和平均回收率均>80%。Fn稳定性研究显示,Fn于4℃存放会发生降解,加入枸橼酸钠+甘氨酸或枸橼酸钠+咪唑复合保护剂能有效抑制Fn降解。结论  采用建立的方法制备Fn是可行的。枸橼酸钠+甘氨酸或枸橼酸钠+咪唑复合保护剂对Fn具有保护作用。     

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