Rag1、Rag2基因缺陷小鼠的构建及在异种肿瘤移植中的应用

目的 建立重组激活基因,Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,并对其表型和异种肿瘤移植的成瘤性进行分析.方法 通过传统的胚胎干细胞(ES)细胞打靶、囊胚注射方式,分别构建Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型;通过流式细胞术对缺陷小鼠外周血T/B淋巴细胞含量进行检测;通过外源异种肿瘤细胞移植实验,对移植肿瘤细胞的成瘤性进行评价.结果 建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种基因突变纯合子小鼠模型外周血中T、B淋巴细胞含量较野生型小鼠显著降低;人源肿瘤细胞A549在上述两种基因突变纯合子小鼠中较BALB/c-nu(裸小鼠)或(NOD-SCID)非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠表现出更强的成瘤性.结论 分别成功建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种小鼠模型均发生了T、B淋巴细胞生成障碍,导致免疫系统严重缺陷,可作为异种外源肿瘤移植的受体,用于小鼠荷瘤模型的建立.     

高分辨率熔解曲线在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中的应用

目的 建立一种基于PCR和在线高分辨率熔解曲线（high-resolution melting curve, HRM）分析工具的检测方法,实现对DNA序列微小差异的快速检测。方法 在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中,采用两步PCR,分别对目的片段进行扩增和富集,并通过免费在线软件对HRM进行分析。结果 HRM分析结果显示,本实验所设计的CRISPR慢病毒系统未能对COS7细胞中的RPE65基因进行有效的基因编辑;而在瘦素突变大鼠的子代基因型中,HRM可以明显区分杂合子和纯合子。结论 HRM能够快速鉴定CRISPR编辑和区分基因型。     

一种体内实时观察黑色素瘤的斑马鱼模型

目的建立一种在体内实时观察黑色素瘤发生发展的斑马鱼模型,为黑色素瘤的相关研究提供一个便捷的活体模型。方法构建红色荧光蛋白标记的黑色素瘤表达系统p MITFa1-Red V12/h Ras,利用小鼠B16黑色素细胞验证其表达效果。再将p MITFa1-Red V12/h Ras载体导入1-细胞期的斑马鱼受精卵中,采用活体成像系统实时观察黑色素瘤在斑马鱼体内的形成过程。结果 p MITFa1-Red V12/h Ras载体在B16细胞中成功表达。显微注射p MITFa1-Red V12/h Ras载体到1-cell期的斑马鱼受精卵3 d后,在荧光显微镜下观察到荧光标记的黑色素瘤;8周后,肉眼可以明显观察到黑色素瘤。黑色瘤的成瘤率达100%。p MITFa1-Red V12/h Ras载体被显微注射到TG(zlyz:EGFP)转基因斑马鱼的受精卵中后,在活体成像系统下清晰地观察到红色荧光标记的黑色素瘤细胞与绿色荧光标记的巨噬细胞的相互作用。结论成功构建了经济简便、易操作的在体内实时观察黑色素瘤的斑马鱼模型。     

丙酸睾酮致小鼠多囊卵巢综合症动物模型的建立

目的 运用雄激素丙酸睾酮早期注射建立不孕症小鼠动物模型 方法 出生5日龄BALB/c小鼠颈背部皮下注射丙酸睾酮,观察阴道上皮细胞角化情况、交配见栓、妊娠情况、雄激素水平、葡萄糖糖耐量及血清胰岛素测定、卵巢病理切片.结果 模型小鼠出现阴道上皮细胞持续角化、交配见栓率、妊娠率显著低于对照组,血游离睾酮水平较对照组小鼠显著升高(P＜0.05),模型鼠的基础血糖较对照组有所升高(P＜0.05),糖代谢正常,模型组胰岛素水平有所升高,但与对照组无显著性差异.卵巢卵泡和正常卵巢相比明显成多囊样发育,见囊状扩张卵泡.结论 丙酸睾酮干预新生小鼠可致雌性小鼠成年后出现交配见栓率低、不孕、血清游离睾酮水平升高,并伴随基础血糖升高,卵巢卵泡呈多囊样改变等多囊卵巢综合症的表现.     

骨保护素基因敲除小鼠发生骨质疏松症的特征

目的研究我国自行开发的骨保护素（OPG）基因敲除小鼠的骨质疏松基本数据及其所属的骨质疏松类型,为其进一步推广应用提供基线数据。方法将野生型OPG（OPG^-WT）小鼠,7和13周龄的骨保护素基因敲除小鼠（OPG^-/-）分成3组（每组6只）,分别检测其血清碱性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）及骨钙素（OC）水平,并行骨密度测定、X线摄片、扫描电镜检查和生物力学测试,将所得数据进行统计学分析。结果OPG^-/-小鼠的骨密度、股骨刚度和最大折断负荷均显著降低（P〈0．01）,血清ALP和ACP明显升高（P〈 0．01）,OC在早期与对照组无明显差异。OPG^-/-小鼠在X线平片上表现为骨量减少,骨小梁稀疏或塌陷,骨皮质变薄。扫描电镜观察到OPG^-/-小鼠骨小梁变细、变尖,骨小梁间隙增大,部分骨小梁塌陷。结论OPG^-/-小鼠骨吸收活性增强伴继发性成骨活性提高,符合高转换型骨质疏松的特征,具有明显的优点,为研究OPG／OPGL／RANK体系提供了新的平台,有可能成为一种新的模型用于高转换型骨质疏松症的实验研究。     

云南白药用于骨质疏松治疗的动物疗效研究

目的探讨云南白药对骨质疏松是否具有治疗效果。方法采用护骨素（osteoprotegerin,OPG）基因敲除小鼠为骨质疏松模型,将7月龄OPG基因剔除小鼠（OPG-/-）分为三组（每组5只）,分别给予云南白药治疗、密盖息治疗和生理盐水治疗。作为对照,将同样背景的野生型小鼠（OPGWT）分为2组（每组3只）,分别给予云南白药和生理盐水治疗。药物干预6个月后,分别检测小鼠血清ALP、ACP水平,行离体骨密度测定、骨生物力学测试,并采用皮下注射盐酸四环素和钙黄绿素进行骨表面的双荧光标记,进行骨形态计量学参数测定,将数据进行统计学分析。结果OPG-/-云南白药治疗组和OPG-/-密盖息治疗组在ALP浓度水平上较生理盐水对照组均有显著性的升高（P〈0．05）。OPG-/-云南白药治疗组的骨矿化沉积率参数较生理盐水对照组有显著上升（P〈0．05）。云南白药治疗组在骨强度、骨形态计量学静态参数上有改善,但和生理盐水组对比,尚无显著差异。结论研究发现云南白药可促使OPG基因敲除模型小鼠血清碱性磷酸酶活性显著升高,骨矿化沉积率显著上升,提示该药可刺激成骨细胞的功能,具有一定的改善骨质疏松的作用。