stathmin基因的表达与长春瑞滨治疗非小细胞肺癌疗效关系

背景与目的: 化疗是晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的主要治疗手段,但是NSCLC常对化疗耐药,导致治疗失败.因此,针对不同分子生物学特点的NSCLC进行化疗疗效预测,成为提高疗效的重要方法.本研究通过研究晚期NSCLC患者肿瘤组织中Stathmin基因的表达与患者对长春碱类药物的化疗敏感性的关系,为患者选择适当的药物治疗提供依据.方法:2005年5月-2007年12月,共78例晚期NSCLC患者入组,随机分ANP方案[长春瑞滨(NVB)联合顺铂(DDP)或卡铂(CBP)]化疗组或GP方案[吉西他滨(GEM)联合DDP或CBP]化疗组,观察两组对化疗的反应;同时以RT-PCR法检测患者病理组织中Stathmin mRNA的表达,以Western印迹法检测Stathmin的蛋白含量.结果: NP组41N,GP组37例,两组患者的性别、年龄、病理类型及肿瘤分期等临床特点无显著性差异(P>0.05),对化疗总的有效率分别为46.3%(19/41)和48.6%(18/37),两者之间亦未见显著差异(P>0.05);在NP组内,有效19例,无效22例,有效患者的肿瘤组织中stathmin mRNA测量值为1.9±1.1,而无效患者为7.5±2.8,两者之间差异有显著性(P=0.003).有效患者的Stathmin蛋白测量值为1.5±0.7.无效组为4.3±1.6,两者之间差异有显著性(P=0.002).GP组18例有效,19例无效,有效与无效患者肿瘤组织中stathmin mRNA及Stathmin蛋白无明显差异(P>0.05). 结论: NSCLC患者肿瘤组织中stathmin基因的表达与患者对长春碱药物的敏感性有关,stathmin基因高表达,对长春碱药物的敏感性低,宜换用其他药物治疗.     

全人源抗肝癌重组免疫毒素的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的:构建及表达全人源抗肝癌MAGE鄄A1单链抗体(A3)与相思子毒素A链(Abrin鄄A)的原核表达载体,并检测其对人BEL7402肝癌细胞系的杀伤作用。方法:应用PCR方法体外扩增A3基因,经测序后重组入原核表达载体pBAD/gⅢ鄄Abrin鄄A相应位点上,将构建正确的pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A表达质粒转化E.coliTOP10,左旋阿拉伯糖诱导表达。表达产物经蛋白纯化及活性鉴定,采用MTT法检测其对BEL7402细胞的体外杀伤作用。结果:构建的重组免疫毒素表达载体pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A,诱导表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约60kD;纯化的pBAD/gⅢ鄄A3/Abrin鄄A对BEL7402细胞的最大杀伤率为70.17%,IC50为3.12μg/ml。结论:构建、表达的全人源抗肝癌A3/Abrin鄄A融合免疫毒素对肝癌细胞有较明显的杀伤作用。     

PGC-1α-shRNA慢病毒载体对牙髓干细胞分化的影响

目的：构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator 1α,PGC-1α）短发夹RNA（short hairp in RNA,shRNA）慢病毒表达载体,体外评价其对牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSC）分化的影响。方法：根据shRNA设计原则,设计合成用于体内干扰PGC-1α编码序列的shRNA,重组入慢病毒载体PLKO.1。将构建正确的PLKO.1/PGC-1α-shRNA感染DSPC,实时荧光定量PCR检测PGC-1α的表达,细胞化学染色和实时荧光定量PCR检测其对DPSC分化的影响。结果：测序证实重组质粒构建成功;体外试验表明,DPSC转染了PGC-1α-shRNA后PGC-1α表达水平降低,干扰效率达81%,而且细胞钙化结节增多,牙本质涎磷蛋白和Ⅰ型胶原的表达明显上调,与对照组相比具有显著性差异（P〈0.05）。结论：慢病毒介导的PGC-1α-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并影响牙髓干细胞的分化。     

pEGFP—N1-Snail真核表达质粒的构建与表达

目的：构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达。方法：利用RT—PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T—Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序。重组质粒双酶切后与pEGFP—N1真核表达载体连接,构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。分别抽提pEGFP—N1及pEGFP—N1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT．PCR检测Snail在该细胞中表达。结果：本实验成功构建了pEGFP—N1—Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达。结论：本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础。     

pEGFP-N1-Snail真核表达质粒的构建与表达

目的:构建pEGFP-N 1 Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达.方法:利用RT-PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序(重组质粒双酶切后与pEGFP-N 1真核表达载体连接,构建pE(;FP-N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功.分别抽提pEGFP-N1及pEGFP-N 1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT-PCR检测Snail在该细胞中表达.结果:本实验成功构建了pEGFP-Nl-Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达.结论:本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础.     

pEGFP-N1/hIL-1ra重组真核表达载体的构建及其在人牙龈成纤维细胞中的瞬时表达

目的:构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞并检测其表达,为牙周炎症的基因治疗提供实验基础。方法:TRIzol法提取人乳腺癌组织总RNA进行RT-PCR,将纯化的扩增产物hIL-1ra与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序正确后将重组体pMD18-T/hIL-1ra与真核表达质粒pEGFP-N1分别进行双酶切,连接后转化感受态细菌E.coliTOP10。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA瞬时转染人牙龈成纤维细胞,荧光显微镜观察绿色荧光的表达,RT-PCR方法检测其基因的表达。结果:构建的pEGFP-N1/hIL-1ra真核表达载体经PCR及双酶切鉴定均表明人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。瞬时转染人牙龈成纤维细胞后能观察到绿色荧光,RT-PCR可得到目的片段。结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞后检测到其基因水平的表达,为炎性细胞因子拮抗剂基因用于牙周炎抗炎治疗奠定了实验基础。     

RNA 干扰抑制人舌鳞癌细胞 MMP-1表达对细胞侵袭、转移能力的影响

目的：探讨基质金属蛋白酶‐1（MMP‐1）短发夹RNA（shRNA）的慢病毒表达载体在人舌鳞癌细胞株CAL27中对MMP‐1表达及细胞侵袭、转移的作用。方法设计合成用于干扰人MMP‐1的shRNA并与载体 PLKO ．1连接,构建重组的慢病毒载体质粒 PLKO ．1／MMP‐1‐shRNA ,稳定感染CAL27细胞。Western blot检测CAL27细胞中MMP‐1蛋白表达,划痕实验和Transwell实验分别检测CAL27细胞的迁移和侵袭能力。结果成功构建慢病毒载体 PLKO ．1／MMP‐1‐shRNA ;其能明显下调CAL27细胞中MMP‐1蛋白表达,抑制CAL27细胞迁移和侵袭能力。结论慢病毒载体PLKO ．1／MMP‐1‐shRNA能有效抑制MMP‐1表达、细胞迁移和侵袭。MMP‐1可能是舌鳞癌细胞转移的重要调节因子。     

Semaphorin 3A及其受体Neuropilin-1在人舌鳞状细胞癌/大鼠背根神经节共培养中对轴突芽生的影响

目的:构建人舌鳞状细胞癌/大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)体外共培养的实验模型,研究神经轴突导向因子Semaphorin 3A(Sema3A)及其受体Neuropilin-1(NRP-1)在肿瘤排斥神经的现象中可能发挥的作用。方法:鉴定Sema3A在人舌鳞状细胞癌细胞系SCC25中的表达以及NRP-1在大鼠DRG神经元中的表达,建立人舌鳞状细胞癌/大鼠DRG体外共培养的实验模型,针对NRP-1靶点进行特异性拮抗,观察SCC25排斥DRG轴突生长的程度变化。结果:免疫荧光结果显示,Sema3A在SCC25中表达,而NRP-1在大鼠DRG神经元中也呈阳性表达;共培养实验结果表明,DRG组织块中NRP-1被特异性拮抗后,SCC25对DRG轴突的排斥程度较对照组明显减弱。结论:Sema3A及其受体NRP-1在SCC25排斥大鼠DRG轴突生长过程中起着重要作用。     

β-tubulin—III基因的表达与长春瑞滨治疗非小细胞肺癌疗效关系的研究

目的：研究非小细胞肺癌（NSCLC）患者肿瘤组织中β-微管蛋白-Ⅲ（[3-tubulin-III）基因的表达与患者对长春碱类药物化疗敏感性的关系，为患者选择适当的药物治疗提供依据。方法：共入选35例NSCLC患者，随机分入长春瑞滨（NVB）联合顺铂（PDD）或卡铂（CBP）组成NP方案化疗组和吉西他滨（GEM）联合PDD或CBP组成GP方案组，观察两组对化疗的反应；同时以RT—PCR法检测患者病理组织中β-tubulin-III mRNA的表达，以Westernblot检测β—tubulin-III蛋白的含量。结果：NP组19例，GP组16例，两组患者临床特点无明显差别，对化疗总的有效率相似，在NP组内，有效10例，无效9例，有效患者的肿瘤组织中β-tubulin．III mRNA测量值为4．8±1．9，而无效患者为15．8±8．0，两者有显著性差异（P〈0．01）；有效患者β-tubulin．III蛋白的测量值为3．7±1．5，无效患者为13．5±6．2（P〈0．01）。GP组7例无效，9例有效，有效与无效患者肿瘤组织中β-tubulin-III mRNA和β-tubulin-III蛋白表达均无显著性差异（P〉0．05）。结论：NSCLC患者肿瘤组织中β—tubulin-III基因的表达与患者对长春碱类药物的敏感性有关，β—tubulin-Ⅲ基因高表达，提示对长春碱类药物的敏感性低，宜换用其他药物治疗。