增强型绿色荧光蛋白在人软骨细胞中的表达及修复重建人软骨示踪方法的研究

目的:检测增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)基因在原代培养的人鼻中隔软骨细胞的转染效率及瞬时表达,建立原代培养的人鼻中隔软骨细胞的示踪方法,为用组织工程法修复重建人软骨寻求示踪方法提供依据。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过Amaxa细胞核转染仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人鼻中隔软骨细胞,应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞仪检测其转染效率。结果:增强型绿色荧光蛋白在基因转染24h后得到了明显表达,48h后流式细胞仪检测其转化率为35.37%,且未影响软骨细胞的贴壁过程。结论:经pEGFP-N1质粒转染的原代培养的人软骨细胞仍能在体外存活,pEGFP-N1是转染原代培养的人软骨细胞较为理想的瞬时表达载体,也是组织工程化软骨形成过程的良好示踪剂。     

不同浓度外源性内皮素1刺激大鼠脑皮质神经元增加释放一氧化氮：首次国内实验直接证实

目的：观察不同浓度内皮素1刺激大脑皮质神经元增加释放一氧化氮的作用。方法：实验于2002-03／2003-02在暨南大学医学院病理教研室、生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心实验室进行。①取新生SD大鼠大脑皮质细胞，神经元体外原代培养至第7天，以10，100nmol的内皮素1刺激神经元，对照组加入等体积磷酸盐缓冲液，以硝酸还原酶法测定间接反映一氧化氮的含量，检验内皮素1对神经元释放一氧化氮的累积效应。分别检测加药前、加药后30min，6h培养基中的一氧化氮浓度。②将培养的神经元分成5组，对照组，10nmol／L内皮素1组、10nmol／L内皮素l+3μmol／L选择性内皮素受体一抗拮剂BQ123组、10nmol／L内皮素1+3μmol／L选择性内皮素受体n抗拮剂BQ788组、10nmol／L内皮素1+3μmol／L非特异性内皮素受体抗拮剂PD145065组。测定加药后6h各培养液中一氧化氮浓度。结果：①10nmol／L，100μmol／L内皮素1组在加药后30min一氧化氮浓度与对照组基本一致，加药后6h培养液中一氧化氮浓度高于对照组(P&;lt;0．05)。②10nmol／L内皮素1组和100nmol／L内皮素l组在加药30min和6h时一氧化氮浓度基本一致(P&;gt;0．05)。③不同内皮素受体拮抗剂对外源性内皮素1刺激神经元释放一氧化氮的影响：10nmol／L内皮素1组、10nmol／L内皮素1+3p．mol／L选择性内皮素受体A抗拮剂BQl23组一氧化氮浓度高于对照组(P&;lt;0．05)。10nmol／L内皮素1+3p．mol／L选择性内皮素受体n抗拮剂BQ788组、10nmol／L内皮素1+3p．mol／L非特异性内皮素受体抗拮剂PD145065组明显低于10nmo|／L内皮素1组(P&;lt;0．01)。结论：10nmol／L和100nmol／L内皮素1对培养液中一氧化氮的影响基本接近，提示内皮素l对皮质培养神经元释放一氧化氮增加的作用在10-100nmol／L间无剂效关系。选择性内皮素受体B抗拮剂BQ788或非特异性内皮素受体抗拮剂PDl45065可完全阻断内皮素1刺激神经元释放一氧化氮的作用，选择性内皮素受体A抗拮剂BQ123对内皮素1刺激神经元释放一氧化氮无影响，提示内皮素1是通过内皮素受体B刺激神经元释放一氧化氮。     

不同浓度外源性内皮素1刺激大鼠脑皮质神经元增加释放一氧化氮首次国内实验直接证实

目的观察不同浓度内皮素1刺激大脑皮质神经元增加释放一氧化氮的作用.方法实验于2002-03/2003-02在暨南大学医学院病理教研室、生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心实验室进行.①取新生SD大鼠大脑皮质细胞,神经元体外原代培养至第7天,以10,100 nmol的内皮素1刺激神经元,对照组加入等体积磷酸盐缓冲液,以硝酸还原酶法测定间接反映一氧化氮的含量,检验内皮素1对神经元释放一氧化氮的累积效应.分别检测加药前、加药后30 min,6 h培养基中的一氧化氮浓度.②将培养的神经元分成5组,对照组,10 nmol/L内皮素1组、10 nmol/L内皮素1+3 μmol/L选择性内皮素受体A抗拮剂BQ123组、10 nmol/L内皮素1+3 μmol/L选择性内皮素受体B抗拮剂BQ788组、10 nmol/L内皮素1+3μmol/L非特异性内皮素受体抗拮剂PD145065组.测定加药后6 h各培养液中一氧化氮浓度.结果①10 nmol/L,100 nmol/L内皮素1组在加药后30 min一氧化氮浓度与对照组基本一致,加药后6 h培养液中一氧化氮浓度高于对照组(P＜0.05).②10 nmol/L内皮素1组和100 nmol/L内皮素1组在加药30 min和6 h时一氧化氮浓度基本一致(P＞0.05).③不同内皮素受体拮抗剂对外源性内皮素1刺激神经元释放一氧化氮的影响10 nmol/L内皮素1组、10 nmol/L内皮素1+3 μmol/L选择性内皮素受体A抗拮剂BQ123组一氧化氮浓度高于对照组(P＜0.05).10 nmol/L内皮素1+3 μmol/L选择性内皮素受体B抗拮剂BQ788组、10 nmol/L内皮素1+3 μmol/L非特异性内皮素受体抗拮剂PD145065组明显低于10 nmol/L内皮素1组(P＜0.01).结论10 nmol/L和100 nmol/L内皮素1对培养液中一氧化氮的影响基本接近,提示内皮素1对皮质培养神经元释放一氧化氮增加的作用在10～100 nmol/L间无剂效关系.选择性内皮素受体B抗拮剂BQ788或非特异性内皮素受体抗拮剂PD145065可完全阻断内皮素1刺激神经元释放一氧化氮的作用,选择性内皮素受体A抗拮剂BQ123对内皮素1刺激神经元释放一氧化氮无影响,提示内皮素1是通过内皮素受体B刺激神经元释放一氧化氮.     

成纤维细胞生长因子和胰岛素促小鼠软骨细胞增殖分化的效应

背景：根据软骨为单一类型细胞组成的无血管组织，对氧和营养的供应要求较低，同种免疫性较低，体内功能较简单，易于在体外构建成可供移植的人工移植细胞系等特点，从建立用于组织工程的通用人类同种软骨细胞系着手，为人工组织和人工器官走向标准化和批量生产奠定基础。目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和胰岛素在原代培养软骨细胞的增殖过程中的效应，为组织工程中细胞因子的应用与作用进行评估。设计：以细胞为研究对象，分组对照重复观察测量。单位：一所大学的组织移植与免疫实验室。材料：实验于2002-11／2003-05在暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室完成，研究对象为随机获取的培养的软骨细胞。方法：在低血清培养基培养条件下进行小鼠原代软骨细胞培养，采用WST1比色法和荧光染色法观察不同浓度bFGF和胰岛素对软骨细胞增殖的影响。主要观察指标：主要结局：①bFGF对小鼠原代软骨细胞增殖影响。②胰岛素对小鼠原代软骨细胞增殖的影响。次要结局：软骨细胞形态学观察。结果：原代软骨细胞在4g／L胎牛血清培养基培养条件下，不同浓度的bFGF和胰岛素对软骨细胞的增殖有剂量相关性。形态学观察表明，bFGF和胰岛素不仅促进细胞增殖，而且可使细胞分泌基质增多。结论：胰岛素和bFGF均能促进软骨细胞的增殖。     

一氧化氮及谷氨酸在内皮素-1诱导神经元凋亡中的作用

目的　观察一氧化氮 (NO)和谷氨酸在内皮素 (ET) 1诱导培养神经元凋亡中的作用。方法　神经元培养取自新生SD大鼠大脑皮质。培养 5天后分 4组 :对照组、ET 1组 (2 0nM)、ET 1 L NAME(N 硝基左旋精氨酸甲酯 ,NO合酶抑制剂 ,1 0 0mM)组和ET 1 APV组 (N 甲基 D 天冬氨酸型受体拮抗剂 ,1 0 0 μM)。培养 2 4h后 ,收集细胞用流式细胞仪定量检测凋亡率。上清液中NO水平通过硝酸还原酶法检测亚硝酸盐浓度反映 ,谷氨酸浓度测定用高压液相法。结果　 2 0nMET 1处理后 2 4h,培养神经元凋亡率较对照组显著增高 (P <0 0 0 1 )。L NAME和APV分别明显阻断ET 1诱导神经元凋亡的作用 ,与ET 1组比较 ,凋亡率降幅分别为 40 % (P<0 0 5)和 80 % (P <0 0 0 1 )。ET 1作用 2 4h后。神经元培养液中NO和谷氨酸浓度较对照组显著增高 (P <0 0 0 1 ) ,L NAME完全抑制了ET 1引起的培养液中NO的升高。结论　NO和谷氨酸参与了ET 1诱导培养大鼠大脑神经元凋亡过程 ,其中谷氨酸更为重要     

山茱萸总甙滴眼液防治角膜移植免疫排斥反应的实验研究

目的：观察山茱萸总甙（COG)滴眼液局部应用对角膜移植免疫排斥反应的影响。方法：建立封闭群大鼠角膜移植模型，随机分组：A、B、C、D组为Wister—SD组问同种异体角膜移植，Wistar为受体，SD为供体，其中A组为空白对照组、B组为0．5％COG滴眼液组、C组为1％COG滴眼液组，D组为2％COG滴眼液组，E组为Wistar—Wistar对照组，即Wistar大鼠间同种异体移植组。用裂隙灯显微镜记录及比较各组：角膜植片透明度、水肿度、新生血管度、移植排斥指数(RI)及角膜排斥发生时间。结果：术后各组移植排斥指数及发生角膜移植排斥时间，A组与B组、A组与C组、A组与D组、B组与C组、C组与D组比较均有显著性差异，P＜0．01；B组与D组之间比较P＞0．05，无显著性差异。结论：COG滴眼液能有效地防治角膜移植免疫排斥反应，1％COG滴眼液更有效。     

CD4+、CD8+、CD25+、CD69+淋巴细胞在种间、同种胚胎植入期母体及同期假孕小鼠淋巴结中的差异

目的：研究种间胚胎植入期母体淋巴结中表达CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋、CD69＋T细胞的百分比变化,并探讨这种变化对种间胚胎植入的影响。方法：利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测种间、同种胚胎移植以及同时期假孕母体淋巴结中表达CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋、CD69＋的T淋巴细胞对应CD3^＋细胞的百分率。结果：与同种胚胎移植后的植入相比,种间胚胎移植后植入期母体淋巴结中,CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD25^＋淋巴细胞占CD3^＋淋巴细胞的比例均极显著低于同种胚胎移植的植入期受体（P〈0.01）;而CD3^＋CD8^＋淋巴细胞占CD3^＋淋巴细胞的比例显著低于同种胚胎移植的植入期受体（P〈0.05）;CD3^＋CD69＋淋巴细胞在种间、同种胚胎植入期母体淋巴结中的比例却无显著差异（P〉0.05）。种间胚胎植入时母体淋巴结中CD4^＋/CD8^＋的比例,与同种胚胎植入受体和假孕小鼠相比,三者之间均无统计学意义上的显著差异（P〉0.05）。结论：种间胚胎移植后从植入期开始,母体淋巴结中的淋巴细胞就发生了不利于胚胎植入的全身免疫反应。     

外伤性视神经损伤后视神经及视网膜形态的动态观察

目的:了解外伤性视神经损伤后的病理变化、溃变特点与时相间的关系。方法:参照Allen脊髓损伤法,造成视神经眶尖段间接600gcm力冲击、挤压伤。伤后对视神经和视网膜行形态学动态观察。结果:①伤后48h,视神经轻度肿胀和空泡反应;1周时损伤处视神经出现溃变,神经胶质细胞增生,视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)形态改变不明显;2周时神经纤维轴束间空泡样改变,局灶性坏死,RGCs核固缩和细胞数量减少。术后3月,视神经损伤部位直径缩小,形成胶质疤痕,RGCs数量明显减少,核固缩细胞增多。②RGCs数量于术后48h、1周、2周、1月和3月分别比正常对照组低3.35%、13.23%、19.74%、23.20%、29.28%。③视网膜细胞在48h内出现凋亡。结论:本实验模型可造成明确的视神经和视网膜损伤,神经元的损伤程度从节细胞、中间神经元、感光细胞的次序依次递减。视网膜和视神经损伤的严重程度与时间呈相关性。RGCs数量在48h至1周时下降速率最快。     

NOD/SCID孕鼠淋巴细胞表型检测和NK细胞活性分析

目的观察NOD/SCID小鼠免疫状况和生育力特征,并分析NK细胞亚群对同基因交配组合NOD/SCID×NOD/SCID妊娠结局的影响。方法采用流式细胞术对未孕和孕13.5 d的NOD/SCID小鼠进行淋巴细胞表型分析,并系统地观察和比较NOD/SCID×NOD/SCID和BALB/c×BALB/c小鼠的生育力特征。分别采用多聚次黄苷酸-胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,poly I∶C)或抗asialoGM1单抗(anti-asialo GM1)刺激或抑制NK细胞活性,并分别观察这些因素对妊娠结局的影响。结果与对照组NOD/SCID小鼠相比,poly I∶C处理组NOD/SCID×NOD/SCID小鼠平均每窝产仔数增多,而注射抗asialo GM1单抗则使胚胎吸收率增高,进而平均每窝产仔数显著减少。结论在NOD/SCID小鼠孕期母-胎界面保持适当水平的NK细胞活性对妊娠结局有利。     

小鼠松果体同基因异体胸腺内移植对免疫衰老作用的研究

目的 探讨小鼠松果体同基因异体胸腺内移植对免疫衰老的作用.方法 将幼龄小鼠松果体移植至老龄小鼠胸腺内,术后切片观察确定手术可靠性.采用实时定量PCR方法对术后受体小鼠胸腺初始T细胞标记物(sjTRECs)进行绝对定量,以评价免疫中枢器官胸腺的生成和输出功能;采用实时定量逆转录PCR方法对术后受体小鼠的几种胸腺状态和功能相关基因的表达进行相对定量,以直接评价胸腺微环境.结果 切片观察到移植的松果体在小鼠胸腺内存活良好;手术组小鼠的胸腺和脾脏淋巴细胞内的sjTRECs 水平高于伪手术组(P＜0.01);与伪手术组的小鼠相比,手术组的小鼠胸腺相关基因表达变化比值为:LMO2:0.78±0.08、Foxn1:5.27±1.58,IL-7:3.46±1.84.结论 松果体移植后老年小鼠胸腺的初始T细胞生成和输出功能有显著的提高,胸腺微环境分泌因子的基因表达显著增加,而负调控因子的表达相对下降,回复了衰老胸腺的功能,因而小鼠松果体移植对于以胸腺退化为先导的免疫衰老有逆转的作用.