恒河猴骨髓源性神经样细胞分化分子机制的基础研究

目的 探讨神经发育音猬因子(SHH)诱导恒河猴骨髓间质细胞(BMSCs)向神经样细胞分化的丝裂原活化蛋白激酶信号分子变化. 方法 密度梯度离心法分离培养恒河猴骨髓干细胞,应用Westem-blot方法检测SHH诱导细胞内信号蛋白变化,免疫组化方法观察丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂对细胞诱导过程的影响. 结果 SHH诱导恒河猴BMSCs分化为神经样细胞分化过程,细胞内激酶p38在加入诱导液5 min后即被激活,随着时间的延长持续升高,1h达到最高峰,诱导前、后p38的总量未见变化;而磷酸化的ERKl/2被抑制,5 min时即开始减少,在2h内逐渐降低,诱导前、后ERKl/2的总量未见变化. 结论 MAPK激酶系统参与SHH诱导恒河猴MSCs分化为神经样细胞分化过程,p38被激活,而ERK被抑制.     

血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建

目的：利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒。方法：实验于2004—08／2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成。自真核表达载体pMD18-T—METH1中酶切出METH1基因，亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1，在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-METH1。以pAd-METH1为模板，经DNA测序正确后，用PacⅠ酶切线性化pAd-METH1，转染293细胞，包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达，采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1。②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasy—METH1。③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论：应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体，制备高滴度重组病毒，为METH1基因功能研究奠定了基础。     

SPF级小鼠超数排卵效果

目的探求小鼠周龄、品系和季节对SPF级小鼠超数排卵效果的影响。方法在春、夏、冬季对4～10周龄的SPF级BALB／c小鼠和KM小鼠进行超数排卵处理，通过见栓率、产胚率、3．5d胚胎获得量及胚胎类型等方面进行统计学分析。结果小鼠周龄、品系和季节对SPF级BALB／c小鼠和KM小鼠见栓率没有影响；对产胚率、3．5d胚胎获得量和胚胎类型等方面有一定影响。结论SPF级BALB／c小鼠宜用9、10周龄的进行超数排卵处理以供应3．5d胚胎为需要所用，而SPF级KM小鼠使用4～10周龄的都可以；另外，SPF级小鼠超数排卵处理仍宜在春、夏季进行，可以保证获得最佳的效果。     

光动力疗法治疗老年黄斑变性临床观察

目的　探讨单次光动力疗法治疗老年黄斑变性合并黄斑脉络膜新生血管的近期疗效。方法　回顾性分析经眼底荧光血管造影及光学相干断层扫描检查确诊的 2 0例 2 0只老年黄斑变性伴有脉络膜新生血管眼经光动力治疗的疗效。随访 3个月。以视力、眼底荧光血管造影及光学相干断层扫描检查为观察指标。结果　按最后一次随访记录分析 ,视力提高 3行者 2例 ;视力提高 2行者 3例 ;提高 1行 5例 ;视力保持不变 1 0例。 1周后眼底荧光血管造影显示 :8例以典型性为主的脉络膜新生血管荧光渗漏停止 ;1 2例轻微典型性和完全隐匿性脉络膜新生血管荧光渗漏均较治疗前减少。随访结束时眼底荧光造影显示 :以典型性为主的脉络膜新生血管 ,4例荧光渗漏停止 ,4例荧光渗漏 ;轻微典型性和完全隐匿性脉络膜新生血管发现 3例渗漏加重 ;9例荧光渗漏减少或不变。术后光学相干断层扫描检查显示浆液性神经上皮脱离明显好转。该组病例治疗过程中及治疗后均未见局部或全身不良反应。结论　光动力疗法短期内能封闭或抑制老年黄斑变性脉络膜新生血管 ,目前尚未见明显的并发症     

巩膜睫状体光凝术对难治性青光眼的中长期疗效

目的　评价经巩膜 810nm半导体激光睫状体光凝术对难治性青光眼的中长期疗效。方法　回顾性地分析了 65例 (65只眼 )经巩膜睫状体光凝的难治性晚期青光眼 ,时间从 1998年 10月至 2 0 0 0年 10月 ,随访 2 4m～ 46m (平均 3 4 1m± 5 8m ) ,观察指标包括包括眼压、视力、用药数量、眼痛情况和眼球萎缩发生率。结果　术前平均眼压 5 1 2mmHg± 14 3mmHg ;最后一次随访 ,平均眼压 16 1mmHg± 11 2mmHg ;最后眼压在 6mmHg～ 2 1mmHg之间者有 41眼 (63 1% ) ,经配对资料T检验 ,术前眼压与术后眼压相比 ,差异有显著性 ,P <0 0 1。术后 46只眼 (70 8% )视力保持不变 ;18只眼 (2 7 7% )视力下降 ;1只眼 (1 5 % )视力增加。抗青光眼用药种类从治疗前的平均3 1种降至治疗后平均 0 4种 (P <0 0 1)。术前有眼痛的患者中 93 3 %的眼痛症状显著缓解或消失。7只眼 (10 8% )发生眼球萎缩。结论　经中长期随访观察 ,810nm半导体激光经巩膜睫状体光凝术仍是治疗难治性青光眼的有效方法。     

光动力疗法对血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞的影响

[目的]研究光动力疗法(PDT)在体外对视网膜色素上皮细胞和血管内皮细胞的影响.[方法]将体外培养的视网膜色素上皮(RPE)细胞和血管内皮细胞与PDT治疗年龄相关性黄斑变性时血药浓度(1.0 μ/mL)相当的光敏剂verteporfin共同孵育,根据孵育时间的不同,每种细胞分成7组,即0 min组、5 min组、15min组、30 min组、60 min组、120 min组和对照组,孵育至上述时间后,分别用光敏剂最大吸收波长的光照(689 nm、功率密度为600 mW/cm2的二极管激光),能量密度为2.4 J/cm2,用MTT法检测24 h后各处理组细胞的存活率.所有实验数据均以均数±标准差的形式表述,数值为3次独立重复实验的平均值,资料统计采用方差分析和t检验.[结果]PDT后24 h,RPE细胞在0 min组、5 min组、15 min组、30 min组、60 min组和120 min组的细胞平均存活率分别为:0.94±0.07、0.68±0.13、0.68±0.11、0.65±0.12、0.49±0.11和0.21±0.11,细胞的存活率随与光敏剂孵育时间的延长而下降,经单因素方差分析,不同时间组的细胞存活率有显著性差异(P=0.000),SNK-q检验,5 min组、15 min组、30 min组、60 min组、120 min组与0 min组比较都有统计学差异;血管内皮细胞在上述各时间组的平均存活率分别为:1.02±0.05、0.78±0.08、0.71±0.11、0.69±0.08、0.62±0.09和0.23±0.11,细胞的存活率随孵育时间的延长而下降,经单因素方差分析,不同时间组的细胞存活率有显著性差异(P=0.000),SNK-q检验,5 min、15 min、30 min、60 min、120 min组与0 min组比较都有统计学差异;PDT后两种细胞在相同时间组的细胞存活率经t检验均无统计学差异(所有P>0.05).[结论]PDT在体外对RPE细胞和血管内皮细胞均有快速地杀伤作用,两种细胞对PDT有相似的敏感性.提示临床上与脉络膜新生血管密切相关的RPE细胞可能受到PDT的损害,提出早期脉络膜新生血管进行PDT治疗可能减少对邻近的RPE细胞或神经细胞的损害.     

罗格列酮对人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖及转化生长因子β1分泌的影响

目的 观察罗格列酮对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞(HTFs)增殖及转化生长因子β1(TGF-β1)分泌的影响.方法 对照实验研究.体外培养HTFs,分别采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色(MTT)法及划线法,对培养细胞分别加入10、20、50、100、250、300、400及500 ms/L的罗格列酮,研究不同浓度的罗格列酮对体外培养的HTFs增殖及移行的影响,同时采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测不同浓度的罗格列酮对细胞TGF-β1分泌量的影响,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,研究不同浓度罗格列酮对TGF-β1 mRNA表达的影响.不同浓度罗格列酮对HTFs增殖活力、TGF-β1分泌及TGF-β1 mRNA合成的影响,采用单因素方差分析(ANOVA);不同浓度罗格列酬对细胞移行数量的影响,采用单因素多水平设计定量资料的方差分析;相邻药物浓度组间吸光度(A)值和细胞移行数量比较,采用q检验.结果 当罗格列酮浓度为20 ms/L时,MTT法测定的A值为0.29±0.02,ELISA法测定的A值为267.48±20.31,RT-PCR测定的A值为0.55±0.02,与对照组(MTT法测定的A值为0.33±0.01,ELISA法测定的A值为323.48±13.69,RT-PCR法测定的A值为0.69±O.02)相比,能明显抑制HTFs的增殖和移行,并明显下调TGF-β1的分泌和TGF-β1mRNA的表达,差异有统计学意义(F=178.293,86.404,176.102;P＜0.01);随着罗格列酮浓度的增高,抑制作用相应增强,相邻药物浓度间A值差异均有统计学意义(q值介于3.00～10.36之间,P＜0.05).结论 罗格列酮能明显抑制HTFs增殖和移行,其作用与其抑制TGF-β1的分泌有关.     

血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建

目的:利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒。方法:实验于2004-08/2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成。自真核表达载体pMD18-T-METH1中酶切出METH1基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-METH1。以pAd-METH1为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-METH1,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达,采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定。结果:①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1。②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasy-METH1。③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,制备高滴度重组病毒,为METH1基因功能研究奠定了基础。