体外培养及其诱导分化人胚胰腺巢蛋白和神经元素3阳性细胞的实验

目的:观察从人胚胎胰腺体外分离培养的巢蛋白和神经元素3阳性细胞,分析其基因表达及诱导分化能力,探讨为胰腺组织工程移植提供种子细胞的可能性。方法:实验于2002-01/2004-05在北京大学干细胞中心完成。实验采用标本为北京市海淀妇产医院产科药物引产的人胚胎,引产药物为米索。使用的胚胎经孕妇同意,并签署同意书。选取18例胎龄为12～24周的人胚胰腺,用Ⅴ型胶原酶消化获得贴壁生长的人胚胰腺细胞,观察其原代培养、传代培养、增殖能力及体外诱导分化能力;胰腺干细胞标志巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达应用免疫荧光染色及反转录聚合酶链反应检测;细胞总蛋白中胰岛素含量应用化学发光法检测。结果:18例胎龄为12～24周的人胚胰腺全部纳入实验。①人胚胎胰腺组织体外培养和诱导分化:人胚胎胰腺组织消化后可获得胰岛样结构,能贴壁生长,传代20代以上,然后进入凋亡期。汇合的细胞加入诱导分化培养基,24h后即可见大部分细胞聚集成团;周围散在贴壁细胞突起细长,立体感增强。随着诱导时间的延长,细胞增殖缓慢,个别细胞脱落、死亡。细胞团易于脱落漂浮,继而死亡。但仍有部分细胞及细胞团贴壁生长。②巢蛋白、胰岛素、胰高血糖素、广谱角蛋白及角蛋白19含量测定:无论是第2代还是第10代细胞中均无胰岛素、胰高血糖素CK-Pan和CK-19染色阳性的细胞。第2代细胞中,巢蛋白阳性细胞约占总细胞数的20%,个别细胞核神经元素3阳性,多数细胞为两者均阴性。第10代细胞中95%以上为巢蛋白强阳性细胞,约90%细胞神经元素3阳性且阳性部位同时存在于细胞核和细胞质中,并与巢蛋白共表达。但第18代细胞,荧光染色神经元素3染色转阴性(反转录聚合酶链反应可检测到少量mRNA的表达),而巢蛋白阳性无明显变化。③诱导前后巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达:诱导前有巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因-1、神经元素3的表达,无胰岛素表达。诱导后出现胰岛素表达,胰十二指肠同源盒基因-1表达增高,巢蛋白和神经元素3表达下降。④胰岛素含量测定结果:诱导分化后,巢蛋白和神经元素3阳性细胞的总蛋白质中含有胰岛素量为2.10IU/g总蛋白,作为阳性对照的人胚胎胰腺组织总蛋白中的含量为2.70IU/g总蛋白,而未诱导的细胞的总蛋白质中未检测到胰岛素。结论:从人胚胎胰腺可以体外分离获得巢蛋白和神经元素3阳性人胚胎胰腺干细胞,为未分化细胞,能在体外大量扩增,可长期培养。总蛋白中有胰岛素表达,有分化为胰岛素阳性细胞的潜能,有望为胰腺组织工程移植提供足够的种子细胞。     

体外培养及其诱导分化人胚胰腺巢蛋白和神经元素3阳性细胞的实验

目的：观察从人胚胎胰腺体外分离培养的巢蛋白和神经元素3阳性细胞，分析其基因表达及诱导分化能力，探讨为胰腺组织工程移植提供种子细胞的可能性。方法：实验于2002—01／2004—05在北京大学干细胞中心完成。实验采用标本为北京市海淀妇产医院产科药物引产的人胚胎，引产药物为米索。使用的胚胎经孕妇同意，并签署同意书。选取18例胎龄为12～24周的人胚胰腺，用Ⅴ型胶原酶消化获得贴壁生长的人胚胰腺细胞，观察其原代培养、传代培养、增殖能力及体外诱导分化能力；胰腺干细胞标志巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达应用免疫荧光染色及反转录聚合酶链反应检测；细胞总蛋白中胰岛素含量应用化学发光法检测。结果：18例胎龄为12～24周的人胚胰腺全部纳入实验。①人胚胎胰腺组织体外培养和诱导分化：人胚胎胰腺组织消化后可获得胰岛样结构，能贴壁生长，传代20代以上，然后进入凋亡期。汇合的细胞加入诱导分化培养基，24h后即可见大部分细胞聚集成团；周围散在贴壁细胞突起细长，立体感增强。随着诱导时间的延长，细胞增殖缓慢，个别细胞脱落、死亡。细胞团易于脱落漂浮，继而死亡。但仍有部分细胞及细胞团贴壁生长。②巢蛋白、胰岛素、胰高血糖素、广谱角蛋白及角蛋白19含量测定：无论是第2代还是第10代细胞中均无胰岛素、胰高血糖素CK-Pan和CK-19染色阳性的细胞。第2代细胞中，巢蛋白阳性细胞约占总细胞数的20％，个别细胞核神经元素3阳性，多数细胞为两者均阴性。第10代细胞中95％以上为巢蛋白强阳性细胞，约90％细胞神经元素3阳性且阳性部位同时存在于细胞核和细胞质中，并与巢蛋白共表达。但第18代细胞，荧光染色神经元素3染色转阴性（反转录聚合酶链反应可检测到少量mRNA的表达），而巢蛋白阳性无明显变化。③诱导前后巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达：诱导前有巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因-1、神经元素3的表达，无胰岛素表达。诱导后出现胰岛素表达，胰十二指肠同源盒基因-1表达增高，巢蛋白和神经元素3表达下降。④胰岛素含量测定结果：诱导分化后，巢蛋白和神经元素3阳性细胞的总蛋白质中含有胰岛素量为2．10IU／g总蛋白，作为阳性对照的人胚胎胰腺组织总蛋白中的含量为2．70IU/g总蛋白，而未诱导的细胞的总蛋白质中未检测到胰岛素。结论：从人胚胎胰腺可以体外分离获得巢蛋白和神经元素3阳性人胚胎胰腺干细胞，为未分化细胞，能在体外大量扩增，可长期培养。总蛋白中有胰岛素表达，有分化为胰岛素阳性细胞的潜能，有望为胰腺组织工程移植提供足够的种子细胞。     

骨髓细胞移植上调急性缺血心肌HSP32和HSP70的表达

目的 :检测骨髓细胞移植在急性心肌梗死大鼠模型中对细胞保护性蛋白HSP32和HSP70表达水平的影响 ,探讨细胞移植早期改善缺血心脏功能的可能机制。方法 :通过结扎冠状动脉左前降支制备大鼠心肌梗死模型 ,直视下心外膜注射 5× 10 6骨髓单个核细胞 ;利用免疫荧光和RT -PCR技术检测HSP32和HSP70在术后 1d、3d、7d和 14d的表达变化和移植细胞的分化情况 ;通过超声心动图分析心脏功能左室射血分数 (EF值 )和缩短分数(FS值 )。结果 :免疫荧光结果显示 ,缺血心肌中HSP32和HSP70的表达在移植组明显增强 ,并表达于部分移植细胞内。RT -PCR结果表明 ,移植组HSP32和HSP70的mRNA表达明显高于对照组 ,术后 3d达到高峰 ,比对照组分别增加 5 .0倍和 2 .9倍 (P <0 .0 1)。术后 7d ,移植组EF值和FS值明显高于同期对照组 (14 %和 2 2 % ,P <0 .0 5 ) ;术后 14d ,可在移植的骨髓细胞中检测到心肌细胞和血管内皮细胞特异性蛋白的表达 ,EF值和FS值进一步增加。结论 :骨髓细胞移植早期 ,细胞移植能够上调细胞保护性蛋白的表达 ,促进急性缺血心脏功能恢复     

骨髓细胞移植上调血管内皮生长因子及其受体的表达并改善缺血心脏功能

目的：通过骨髓细胞移植对心肌梗死大鼠模型血管内皮生长因子及其受体表达的影响，探讨骨髓细胞移植改善缺血心脏功能的可能机制。方法：利用左前降支冠状动脉结扎术制备大鼠心肌梗死模型，然后行异体骨髓细胞移植；分别于术后1d，3d，7d，14d和28d取材；利用免疫荧光和RT—PCR技术分析细胞移植对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Flk一1)表达的影响和移植细胞的分化情况；通过免疫组化计算血管数量；应用血流动力学检测大鼠心脏功能在术后各时间点的变化。结果：VEGF和Flk-1在移植组动物的心肌梗死区残存细胞、梗死周边区细胞以及部分移植细胞内表达。移植组VEGF和Flk-1的mRNA表达明显高于对照组。分别于术后3d和14d达到高峰，以后逐渐减弱。术后7d，14d和28d移植组血管数量较同期对照组明显增加，移植组心脏功能较对照组明显改善。术后14d可在部分移植细胞中检测到心肌细胞或血管内皮细胞特异性蛋白的表达。结论：骨髓细胞移植通过上调移植细胞及受者内源性VEGF和Flk—1的表达，促进血管新生，进而改善缺血心脏功能。     

体外诱导Balb／C小鼠ES细胞定向分化为胰岛样细胞团的形态观察

目的 体外诱导Balb／C小鼠胚胎干细胞定向分化为胰岛样细胞团，观察细胞表面形态学的变化。方法 选用Balb／C小鼠ES细胞．经过拟胚体(EB)发育分化4d后开始定向诱导培养，不同时问段分别向细胞培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和尼克酰胺和N等细胞生长因子，使ES细胞定向分化为胰岛样细胞团。免疫细胞化学检测表达胰岛素和胰高血糖素的阳性细胞。原子力显微镜(AFM)原位扫描阳性细胞团。结果EB细胞生长为大小不一、境界清楚的细胞团，细胞团内细胞排列紧密。胰岛B细胞数量多，主要分布在细胞团的中央，边缘少，染色较淡。而表达胰高血糖素的A细胞主要分布在细胞团的边缘，数量相对较少。AFM扫描可见表达胰岛素的阳性细胞团，其表面有很多类似神经纤维的纤维束，连接成网络状。在细胞质中，还有很多类圆形的颗粒物质，其大小几乎一致．粒径都处于0．5～1．0μm间。结论 诱导分化得到的细胞团不仅有形态和功能上的成熟，而且还具备良好的组织结构，为细胞的移植疗法提供了可靠的凭据。     

体外诱导Balb/C小鼠ES细胞定向分化为胰岛样细胞团的形态观察

目的体外诱导Balb/C小鼠胚胎干细胞定向分化为胰岛样细胞团,观察细胞表面形态学的变化。方法选用Balb/C小鼠ES细胞,经过拟胚体(EB)发育分化4d后开始定向诱导培养,不同时间段分别向细胞培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和尼克酰胺和N等细胞生长因子,使ES细胞定向分化为胰岛样细胞团。免疫细胞化学检测表达胰岛素和胰高血糖素的阳性细胞。原子力显微镜(AFM)原位扫描阳性细胞团。结果EB细胞生长为大小不一、境界清楚的细胞团,细胞团内细胞排列紧密。胰岛B细胞数量多,主要分布在细胞团的中央,边缘少,染色较淡。而表达胰高血糖素的A细胞主要分布在细胞团的边缘,数量相对较少。AFM扫描可见表达胰岛素的阳性细胞团,其表面有很多类似神经纤维的纤维束,连接成网络状。在细胞质中,还有很多类圆形的颗粒物质,其大小几乎一致,粒径都处于0.5~1.0 μm间。结论诱导分化得到的细胞团不仅有形态和功能上的成熟,而且还具备良好的组织结构,为细胞的移植疗法提供了可靠的凭据。     

神经干细胞研究新进展及临床应用展望

传统观念认为,中枢神经组织成熟或损伤后不能再生,但这一观念现已被打破.近年来科学家发现成人的中枢和外周神经系统中都有神经干细胞的存在,但大部分神经干细胞在体内处于静止状态,因此从体内分离神经干细胞、为治疗神经系统疾病提供丰富的细胞来源,是目前神经干细胞研究的热点之一. 1 神经干细胞概述 干细胞(stem cell)是指具有自我复制能力、能够分化成为至少一种功能细胞的早期未分化细胞.根据干细胞分化潜能的大小,可分为全能干细胞、多能干细胞以及只能向一种细胞类型分化的单能干细胞.神经干细胞(neural stem cell, NSC)属于多能干细胞,在一定微环境中可分化出神经元和胶质细胞.神经干细胞至少具备3种特性 [1]:(1)缺乏神经系统分化的标志;(2)自我复制能力;(3)多潜能性,即能分化成神经组织的各种细胞.     

人骨髓间质干细胞与新型可降解材料生物相容性的实验研究

目的：本研究利用人骨髓间质干细胞（MSC）的增殖与分化潜能作为指标，对可降解偏磷酸钙（dCMP）材料和羟基磷灰石（HA）材料的生物相容性进行体外研究。 方法： 通过扫描电镜观察MSC在dCMP表面粘附的情况，并利用ICP和IC分析dCMP和HA的降解产物元素含量，同时采用FACS、ALP活性检测及ARS等方法对降解产物的毒性效应进行检测。 结果： dCMP对MSC的增殖有促进作用，且不影响MSC的成骨分化进程及分化后的矿化功能；而HA对MSC的成骨分化进程无影响，但对MSC的增殖和成骨分化后的矿化功能均有抑制作用。 结论： dCMP的生物相容性较HA为佳，更适合作为骨替代材料。     

放射性碘标记转铁蛋白体外示踪脊髓内移植的间充质干细胞

目的:检测间充质干细胞转铁蛋白受体(TfR)在体外培养及移植入脊髓后的表达,进行体外放射性核素示踪研究.方法:从胎儿血分离培养人间充质干细胞,应用流式细胞分析、免疫荧光染色和受体放射性分析鉴定转铁蛋白受体的表达,用放射性碘(125I)标记的铁饱和转铁蛋白[125I-Tf(Fe)2 ]作为示踪剂,进行体外放射自显影,示踪移植于兔正常脊髓内的间充质干细胞,并对125I-Tf(Fe)2在脊髓实质的弥散动力学进行研究.结果:流式细胞分析、免疫荧光染色证实体外培养的人间充质干细胞表达转铁蛋白受体, 受体放射性分析表明125I-Tf(Fe)2与其受体结合的平衡解离常数(KD)为(0.98±0.12) nmol/L, 最大结合位点(Bmax)为每个细胞(107 702±6 226)个.免疫荧光染色结果表明间充质干细胞移植于脊髓2 d后转铁蛋白受体表达,10 d后不表达,移植2 d后以125I-Tf(Fe)2为示踪剂进行脊髓切片体外放射自显影,获得移植细胞阳性影像.离体脊髓在125I-Tf(Fe)2溶液中体外孵育,16 h后 125I-Tf(Fe)2弥散入全部脊髓实质.结论:125I-Tf(Fe)2作为示踪剂可以在体外示踪到脊髓内移植2 d后的间充质干细胞,TfR和125I-Tf(Fe)2是应用核医学影像进行间充质干细胞移植初期活体示踪可能的生物学标志和示踪剂.     

从胎儿胰腺组织建立单克隆胰腺前体细胞的研究

目的 探索一种新的人胰腺干细胞分离纯化体系。方法 从胎儿胰腺中分离获得巢蛋白阳性细胞群体，荧光激活细胞分选(FACS)技术分选单个side population(SP)细胞后进行单克隆细胞培养。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及放射免疫分析(RIA)方法，研究单克隆SP细胞在体外增殖和向胰岛内分泌细胞分化的能力。结果 胎儿胰腺组织经过分离和体外培养后，可获得巢蛋白阳性细胞，对其进行Htoechst 33342染色，分析显示SP细胞约占0．1％；RT-PCR证实SP细胞有ATP结合盒转运子G2(ABCG2)表达，而非SP细胞则未见表达；SP细胞的克隆形成率约为2．7％，而非SP细胞没有克隆形成。在多种细胞因子和无血清的条件下，单克隆SP细胞经诱导后出现胰岛素、胰升糖素和胰十二指肠同源盒基因-1(PDX-1)mRNA的表达，而巢蛋白、neurogenin3 (Ngn3)和ABCG2 mRNA表达消失；RIA分析可检测到诱导后的细胞内有胰岛素产生。结论 首次报道从胎儿胰腺组织中分离并建立了单克隆胰腺前体细胞。该细胞在体外具有很强的增殖能力，并可分化为胰岛内分泌细胞。