进展期肝癌患者氩氦刀冷冻消融术前中性粒细胞/淋巴细胞比值与术后预后关系研究

目的探讨氩氦刀术前中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil/lymphocyte ratio,NLR)与进展期肝癌患者术后生存期的关系。方法回顾性分析2008—2009年在我院行氩氦刀冷冻消融治疗的150例进展期肝癌患者临床资料,根据术前NLR中位数(2.94)将患者分为2组(高NLR组和低NLR组),对2组进行生存分析和Cox回归分析。结果氩氦刀冷冻消融术前病理组织分化程度、NLR和肝硬化Child-Pugh分级是术后进展期肝癌患者生存期的影响因素。术前高NLR组患者生存期为5个月(95%CI 3.5~6.4),而低NLR组患者生存期为9个月(95%CI 6.9~11.0),2组生存期差异有统计学意义。结论 NLR2.94的进展期肝癌患者行氩氦刀冷冻消融治疗预后较差。     

乙型肝炎病毒感染与肝细胞癌发生关系的分子病理学研究

乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是肝细胞癌发生的重要原因之一,但确切的分子机制仍不清楚.     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功.     

索拉非尼联合冷冻消融治疗乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌的研究

目的 探讨索拉非尼联合局部冷冻消融治疗进展期乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌(HCC)的疗效及安全性.方法 收集2007年7月-2009年9月收治的102例进展期肝细胞癌患者,均为HBV感染,随机分为2组,S+C组(n=50)给予索拉非尼联合冷冻消融治疗,C组(n=52)仅给予冷冻消融治疗.每4～6周按照实体瘤疗效评价标准(RECIST)进行疗效评价,治疗终点为肿瘤进展或出现不可耐受的毒性.按美国癌症研究所的常规毒性判定标准(NCI-CTC)评价治疗后的不良反应,随访生存期及肿瘤进展情况.结果 S+C组2例完全缓解(CR),9例部分缓解(PR),22例疾病稳定(SD),疾病控制率(DCR)为66.0%.C组0例CR,4例PR,19例SD,DCR为44.2%.S+C组患者中位生存期(OS)和中位肿瘤进展时间(TTP)分别为11.0和6.0个月,而C组分别为7.5和3.5个月,两组间差异有统计学意义(P<0.01).S+C组患者出现皮疹、高血压、手足综合征、腹泻、肝功能异常、白细胞减少、上消化道出血等不良反应的比例分别为62%、54%、42%、42%、34%、20%和12%,其中发生3级以上严重并发症的患者分别为4%、2%、22%、6%、6%、4%、6%.结论 索拉非尼联合局部冷冻消融治疗进展期HCC安全、有效,能显著延长进展期HCC患者的生存期及肿瘤进展时间.     

抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。     

乙肝病毒HBX抗原与p53相互作用及其对肝细胞癌发生的影响

HBC抗原是乙肝病毒最小编码杠X基因区编码的蛋白，研究证明它与HBV相关性肝癌的发生有关；抑癌基因p53的变异或失活也与肝细胞癌（HCC）的发生密切相关。研究HBX抗原与p53的相互作用关系，有助于进一步揭示HBV相关性肝癌的发病机制。     

ConA性小鼠肝损伤模型的研究及应用

自身免疫性肝病、病毒性肝炎等所致的肝损害 ,均与Ｔ淋巴细胞的活化密切相关[1] ,而多年来所应用的实验肝损害模型(如细菌脂多糖、Ｄ 氨基半乳糖所介导的肝损害 ) ,多不能很好地反映这一病理特点。 1992年 ,Ｔｉｅｇｓ等[2 ] 成功地应用刀豆蛋白Ａ(ＣｏｎＡ)诱发了小鼠特异性肝损伤 ,这一实验模型是近年来新发展起来的由Ｔ淋巴细胞介导的肝损害 ,它的建立和应用为深入研究肝细胞损害的细胞学与分子学机制以及进行治疗药物筛选提供了更为方便和理想的实验动物模型。本文综述这一肝损害模型的研究与应用现状。一、ＣｏｎＡ肝损害模型特点(一 )…     

ConA诱发昆明小鼠特异性肝脏损害模型的建立

目的：研究刀豆素A(ConA)能否诱发昆明小鼠特发性肝损害。方法：ConA将刀豆素A用于昆明小鼠，并成功地诱发了T细胞介导的特异性肝脏损害。结果显示：该实验模型所造成的肝脏损害为ConA剂量依赖性：肝组织病理示，门管区大量淋巴细胞浸润，并可见点片状肝细胞坏死。以环孢霉素A(CSA)预先抑制T淋巴细胞活化，则未见肝脏损害，肝组甥病理也未发现淋巴细胞的浸润。结论：该实验模型进一步验证了ConA性肝损害为无种属特异性的T细胞依赖性肝损害模型，同时也为深人研究病毒性肝炎、自身免疫肝病等病理机制提供了又一方便、理想的实验模型。     

p14ARF基因通过p53途径对肝癌细胞的生长的影响

目的　探讨 p14 ARF对含有野生型 p5 3(wtp5 3)的肝癌细胞生长的影响及其作用机制。方法　将含p14 ARF的基因转染到人肝癌细胞HepG2中 ,通过流式细胞仪及生长曲线观察其对HepG2细胞周期及细胞生长的影响。利用Western Blotting方法及 p2 1waf1启动子荧光素酶活性检测p14 ARF对HepG2细胞 p5 3蛋白表达的影响。 结果　转染p14 ARF基因的HepG2细胞的生长速度从第 3天开始较空载体 pcDNA 3组减慢 ,处在G0 G1期细胞数 ( 70 .6 6 % )与空载体组 ( 6 1.5 5 % )相比明显增加 ,转染 pcDNA3p14 ARF( 1.0 92 3± 0 .0 370 ) p2 1waf1启动子荧光素酶活性较空载体组( 0 .76 73± 0 .0 180 )明显升高 ( P <0 .0 5 )。Westernblotting结果表明 ,p5 3表达也明显增加。 结论p14 ARF基因通过上调HepG2细胞的 p5 3表达导致 p2 1waf1的表达升高使细胞阻滞于G0 G1期 ,从而抑制细胞的生长。     

P53与乙型肝炎病毒增强子Ⅰ上游P53样应答元件结合序列关系研究

背景与目的:在前期工作中,我们经计算机序列分析发现,在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因组增强子Ⅰ上游1047～1059 bp存在P53样应答元件结合序列5′-TGCC(G)TTGCCT-3′,体外实验应用凝胶迁移方法(EMSA和EMSSA)发现这段序列与P53蛋白能够进行特异性结合.本实验拟观察肝癌细胞中P53蛋白与HBV基因组P53样应答元件结合序列之间的关系.方法:报告基因质粒pX-CAT上游为X基因增强子和启动子序列,其中含有P53样应答元件结合序列5′-TGCGTTGCCT-3′.首先用PCR方法将pX-CAT质粒中5′-TGCGTTGCCT-3′进行点突变,成为5′-TGTATTGTAT-3′,以破坏P53样应答元件结合序列.将pX-CAT和变异后的pX-CAT(mpX-CAT)分别单独或与pCMV-p53质粒共转染HepG2细胞,通过检测报告基因CAT的活化情况,观察P53蛋白与这段DNA序列的作用关系.将HBV基因P53样应答元件结合序列反向构建于真核表达质粒pZeoSV2中(αpZeoXP),转染HepG2.2.15细胞并稳定筛选,以封闭HBV基因上P53样结合位点,观察细胞中P53/P21蛋白表达的改变,以及细胞周期、细胞凋亡的变化.结果:HepG2细胞中,报告基因CAT活性在pCMV-p53与pX-CAT共转染组较pX-CAT单独转染组明显升高(1.353 vs 0.738,P＜0.05),而mpX-CAT单独转染组CAT活性则明显降低(0.304),即使与pCMV-p53共转染CAT活性也较低(0.402).与对照组相比,稳定转染了αpZeoXP的HepG2.2.15细胞中,P53、P21蛋白表达水平降低;细胞周期检测显示,与对照组相比,处于S期的细胞数增多(16.37%vs 9.48%),而细胞凋亡数减少(0.95%vs7.84%).结论:P53可促进pX-CAT报告基因在细胞内的表达,进一步提示P53与HBV增强子上游5′-TGCC(G)TTGCCT-3′序列存在结合作用,二者作用可能通过导致细胞内P53蛋白半衰期延长,而使细胞中P53及其下游基因P21蛋白表达水平和活性升高.