重组腺相关病毒介导抑癌基因联合诱导人肝癌细胞系凋亡与生长抑制研究

目的 观察腺相关病毒介导的抑癌基因p53,p16和p21联合治疗肝癌的可能性和效果。方法 用携带人野生型p53,p16和p21的腺相关病毒分别或联合转导人肝癌细胞系HLE，HepG2,QGY-7701,QGY-7703,BEL-7402,SMMC-7721，通过体外及裸鼠体内实验研究转基因的表达及对癌的促凋亡和生长抑制作用。结果 腺相关病毒介导的p53,p16及p21对人肝细胞肝癌细胞系均有明显的促凋亡作用，体外凋亡率约30％左右，体内生长抑制率30％－44％；联合感染肝癌细胞效果更明显，体外凋亡率达56％，体内癌生长抑制率65％。结论 腺相关病毒介导的外源抑癌基因p53，p16和p21不仅对多种肝癌细胞系均有诱导凋亡和抑制生长作用，联合应用治疗肝癌更具有明显的相互协同作用。进一步提高病毒滴度和纯度是腺相关病毒作为载体进行基因治疗的目标。     

肿瘤-睾丸抗原SSX1基因mRNA在肝细胞肝癌中的表达

目的：检测肿瘤－睾丸抗原SSX1基因mRNA在肝细胞肝癌（HCC）中的表达情况。方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）对47例HCC患者的癌组织和相应癌旁组织以及15例肝硬化和15例正常肝组织的SSX1基因mRNA表达情况进行检测，随机选择4例RT－PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定。结果：47例HCC患者中，39例表达SSX1 mRNA，阳性率为83％，相应的癌旁组织中有3例为弱阳性，其中2例患者获得了离癌灶更远处的活检组织，对其进行RT－PCR检测，结果显示阴性；所测的15例肝化和15例正常肝组织均未检测到SSX1的表达。4例DNA测序结果表明RT－PCR产物确为SSX1 cDNA。SSX1的表达与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、血清甲胎蛋白（AFP）水平、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染无显著相关性（P＞0．05）。结论：SSX1在HCC中呈高比例、高特异表达，可望成为HCC免疫治疗的理想靶位。     

组织胺及其1、2型受体阻断剂对贮脂细胞收缩的影响

目的　探讨组织胺及其1型受体(H1R)阻断剂、2型受体(H2R)阻断剂对贮脂细胞收缩的影响。方法　采用肝脏离体胶原酶灌注消化及密度梯度离心的方法来分离培养贮脂细胞；用二甲基多聚硅烷烧制聚硅酮膜；传代后的贮脂细胞在聚硅酮膜上培养3d后，随机分为5组A组(对照组)；B组(组织胺1×10-7mol/L组)；C组(组织胺1×10-6mol/L组)；D组(H1R阻断剂+组织胺1×10-6mol/L组)和E组(H2R阻断剂+组织胺1×10-6mol/L组)。各组于加药前及加药后20min摄相，在相片上分析同一视野细胞周围的聚硅酮膜皱纹变化，皱纹增多表明细胞收缩。结果　B组、C组的贮脂细胞收缩率分别为21.0%、34.2%，远高于A组的3.8%，并呈量效依赖关系（P＜0.001）；D组的贮脂细胞收缩率为17.7%，低于C组（P＜0.05）；E组的贮脂细胞收缩率为26.3%，与C组相比，差异无显著性（P＞0.05）。结论　组织胺通过H1R的介导促进贮脂细胞的收缩，可能在门静脉高压症的发生发展中起了一定的作用。     

γ干扰素刺激肝细胞癌细胞表达共刺激分子和主要组织相容性复合物的研究

目的 研究共刺激分子（CD80和CD86）和主要组织相容性复合物（MHC）在肝细胞癌（HCC）细胞中的表达，探讨γ干扰素（γ－INF）治疗HCC中的免疫作用机理。方法 应用流式细胞仪测定CD80、CD86和MHCⅡ类分子HLA－DR，以及应用微量细胞毒方法测定MHCⅠ类分子在γ－INF刺激前后8种HCC细胞中的表达。结果 所有未受刺激的HCC细胞的CD80、CD86和HLA－DR表达率均不超过3.58%，只有3种细胞中测到MHCⅠ类分子的表达；γ－INF以10^6U／L的浓度刺激48h后，所有8种HCC细胞HLA－DR表达率均升高，其中7种升高至18％以上，5种升高至70％以上，荧光强度增强10－50倍；刺激后，在8种细胞中均可测到MHCⅠ类分子表达；刺激后，所有8种HCC细胞CD86表达率均升高，7种升高至12.35%-17.10%，5种HCC细胞CD80表达率升高至5％－10％。结论 γ－INF刺激可使多数被研究的HCC细胞获得一定的抗原呈递能力，同时可使所有被研究的HCC细胞获得被细胞毒T淋巴细胞识别和杀伤的条件。     

肝癌特异性p53基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建一种肝癌细胞靶向性的腺相关病毒载体以用于肝癌的促凋亡基因治疗的研究。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物,选择地从人基因组中出入甲胎蛋白（α－fe-toprotein,AFP）启动子序列并克隆以真核表达载体pTR－UF5上;再通过平端连接的方法,构建成含甲胎蛋白启动子和人野生型p53基因的重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）质粒rAAV－AFP－53和绿色荧光蛋白基因GFP（green fluorescence protein）的质粒rAAV－AFP－GFP。结果 成功地构建了以腺相关病毒为载体、受人甲胎蛋白启动子调控表达人野生型p53基因的质粒系统。结论 从理论上说,我们构建的重组腺相关病毒质粒rAAV－AFP－p53,可以特异性地转染到肝癌细胞中从而为肝癌基因治疗提供一种有效手段。     

黑色素瘤抗原基因在肝细胞癌细胞株中的表达

黑色素瘤抗原基因 (ＭＡＧＥ)是ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ等[1] 于 1991年发现的重要的肿瘤相关基因 ,在肝癌标本中ＭＡＧＥ 1表达率达 80 %左右 ,应用ＭＡＧＥ抗原肽对手术、化疗等常规方法治疗效果差的肝细胞肝癌 (ＨＣＣ)进行免疫治疗有一定的应用价值和可行性[2 ,3 ] 。应用ＭＡＧＥ抗原肽对ＨＣＣ进行免疫治疗的体外研究的关键是 ,诱导出对带有ＭＡＧＥ抗原的靶细胞具有特异性杀伤性能力的细胞毒淋巴细胞 (ＣＴＬ)。本实验对 8种ＨＣＣ细胞株ＭＡＧＥ基因的表达和人类白细胞抗原一类抗原 (ＨＬＡⅠ类抗原 )类型进行了研究 ,筛选出相…     

改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定

目的:改良大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的分离培养及鉴定方法,使之简便易行,高效可靠.方法:采用肝离体胶原酶灌注消化,低速离心去除肝细胞,密度梯度离心法分离HSC,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定HSC纯度.结果:采用改良法,每只大鼠的HSC得率为(2.54±0.13)×107个,细胞活率为(98.8±0.7)%,高于旧方法的HSC得率[(2.18±0.18)×107个,P＜0.01]和活率(94.3±0.6)%,P＜0.01].用desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定,HSC纯度为(96.8±1.0)%,高于单用desmin鉴定的纯度(91.8±2.2)%(P＜0.01).结论:改良的大鼠HSC分离培养方法简便易行又经济,在保证纯度的同时,提高了得率和活率.采用desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定细胞纯度,提高了鉴定的敏感性.