亚洲带绦虫烯醇化酶基因的原核表达、鉴定与组织定位

目的 表达亚洲带绦虫（Taenia asiatica,Ta）成虫烯醇化酶（enolase,ENO）基因,并对其进行组织定位和免疫反应性分析。 方法 通过大规模测序从亚洲带绦虫cDNA文库中确定ENO基因,PCR扩增目的片段,将其克隆至表达质粒pET-30a（+）,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察重组蛋白的表达情况,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化重组蛋白,蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组蛋白的免疫反应性。将重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体水平,间接免疫荧光检测确定ENO在亚洲带绦虫成虫组织中的定位。 结果 PCR、双酶切和DNA测序结果均表明,重组质粒pET-30a（+）-TaENO构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白TaENO的相对分子质量（Mr）为47 000。经亲和层析获高纯度的蛋白,蛋白浓度为0.37 mg/ml。重组蛋白TaENO能被SD大鼠抗血清、感染亚洲带绦虫的猪血清和患者血清识别。间接免疫荧光检测结果显示,TaENO主要定位于成虫的表膜。 结论 纯化后的亚洲带绦虫成虫烯醇化酶重组蛋白具有较强的免疫反应性,烯醇化酶主要定位于成虫表膜。     

亚洲牛带绦虫TaCRISP基因克隆、表达和序列分析

目的 通过筛选亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)成虫cDNA质粒文库,识别半胱氨酸分泌蛋白(Ta CRISP),并进行克隆表达,为进一步研究其功能提供基础依据.方法 用生物信息学方法从亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别TaCRISP的全长编码基因并预测编码蛋白质的各种结构与功能;将其编码区序列克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,测序鉴定重组质粒,之后进行诱导表达,表达产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定.结果 该基因全长1 090bp,编码239个氨基酸,1aa-16aa位为分泌信号肽,理论分子量为26 973.8,等电点为5.96.生物信息分析揭示,Ta CRISP与中殖孔绦虫CRISP一致性为38%,相似性为54%;所构建的重组体经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符.SDS-PAGE结果表明,目的 基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中表达成功.结论 发现亚洲牛带绦虫Ta CRISP基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白.     

亚洲带绦虫膜联蛋白B3基因生物信息学分析

目的 识别亚洲带绦虫新基因,分析和预测该基因及其编码蛋白的结构和特性,为其生物学功能研究提供依据.方法 利用在线生物信息学网站及工具进行序列分析、预测其编码的膜联蛋白B3的理化特性、抗原表位、翻译后的修饰、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象、进化树等.结果 该基因全长1176 bp,编码区为70～588 bp,编码173个氨基酸,为全长基因;无跨膜区;具有多个磷酸化位点和B细胞线性表位;蛋白的理化性质稳定,理论分子量为19339.7;没有质体、线粒体定位序列;氨基酸序列高度保守.结论 运用生物信息学方法 从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中识别出了亚洲牛带绦虫成虫膜联蛋白B3基因,并对其所编码的蛋白质的结构与功能进行预测.     

亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因的原核表达和免疫学分析

【目的】对亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因（CaN）进行克隆、表达和免疫学初步研究。【方法】将亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因克隆到原核表达质粒pET-30a（＋）中，在大肠杆菌BL-21／DE3中用诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）进行鉴定，用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化，纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。【结果】PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-30a（＋）-TaCaN构建成功。SDS—PAGE结果表明目的基因能在大肠杆菌BL．21／DE3中表达，经亲和层析得到了纯化重组蛋白。重组蛋白能被感染了亚洲牛带绦虫的猪和患者的血清识别。[结论]亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达。为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

猪带绦虫乳酸脱氢酶A和B的生物信息学比较分析

目的预测及比较分析猪带绦虫乳酸脱氢酶A（Taenia solium lactate dehydrogenase A,TsLDH-A）和乳酸脱氢酶B（Taenia solium lactate dehydrogenase B,TsLDH-B）,用于指导其生物学功能的研究。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：//ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别LDH-A和LDH-B的全长编码基因并对其结构与功能进行生物信息学预测分析。结果两序列都是包含完整开放阅读框的全长基因,推导出的氨基酸序列与其它物种LDH-A或LDH-B同源基因的氨基酸序列的一致性均大于50%。两者编码的蛋白在编码的氨基酸数目（331）、蛋白的理化性质、L-乳酸脱氢酶结构域、构成LDH酶催化中心的关键氨基酸、包含LDH活性位点的线性表位、无亚细胞定位等方面是一致的,但两者在翻译后的修饰位点、3个跨膜区和其他线性表位方面既相似也有区别。结论应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了TsLDH-A和TsLDH-B的cDNA全长序列,并预测和比较了两者结构与功能方面的信息,为进一步研究所编码蛋白的功能奠定了基础。     

抗亚洲带绦虫药物对乳酸脱氢酶抑制作用

目的探讨抗亚洲带绦虫药物对于重组的亚洲带绦虫乳酸脱氢酶(Ta.LDH)酶促功能的影响。方法将不同浓度的吡喹酮、阿苯达唑和甲苯咪唑加入Ta.LDH所催化的丙酮酸还原成乳酸(正反应)以及乳酸氧化成丙酮酸(逆反应)的标准反应体系当中,测定烔?废汆堰?核苷酸(NADH)在A340处吸光度的变化值。采用SPSS 16.0软件进行分析,计算药物对酶活性的相对抑制率。结果与对照组比较,0.10 mmol/L吡喹酮对Ta.LDH催化正逆反应的相对抑制率分别为93.99%(P0.01)和94.67%(P0.01),0.10 mmol/L阿苯达唑分别为85.45%(P0.01)和73.81%(P0.01);0.15 mmol/L甲苯咪唑分别为92.2%(P0.01)和86.13%(P0.01)。结论Ta.LDH可能为吡喹酮、阿苯达唑和甲苯咪唑抗亚洲带绦虫药物作用的靶标分子。     

牛带绦虫乳酸脱氢酶基因原核表达及免疫学特征

目的 克隆牛带绦虫乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因在大肠杆菌中表达,研究其免疫学特征.方法 将牛带绦虫成虫LDH基因与质粒pET-28a(+)连接构建原核重组质粒,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blotting)进行分析.结果 牛带绦虫乳酸脱氢酶基因编码332个氨基酸,理论分子量为35.4kDa,PCR、双酶切及DNA测序的结果均证明pET-28a(+)-LDH构建成功;SDS-PAGE结果表明,牛带LDH基因在大肠埃希菌高效表达,经过亲和层析高纯度蛋白,且该重组蛋白可以被亚洲带绦虫、牛带绦虫及猪带绦虫感染病人血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 牛带绦虫LDH基因可在原核系统中有免疫活性的高效表达.     

亚洲牛带绦虫NOMO1基因在原核细胞中表达

目的 构建亚洲牛带绦虫NOMO1基因原核重组质粒,进行原核表达、纯化及免疫学研究.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含NOMO1基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒后再行诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,并用蛋白免疫印迹(Western-blotting)分析其免疫反应性.结果 成功建构了原核重组质粒pET28a(+)-NO-MI1.该基因在大肠埃希菌中以包涵体形式存在,破包涵体后纯化蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3得到高效表达.Western blotting结果显示,该重组蛋白可被亚洲牛带绦虫、牛带绦虫病人血清识别,具有免疫反应性.结论 成功克隆亚洲牛带绦虫NOMO1基因、表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

亚洲牛带绦虫肌动相关蛋白基因克隆及表达

目的 对亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)成虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4(Actin related protein 2/3 complex subunit 4)基因进行克隆、表达和免疫学研究.方法 以亚洲牛带绦虫eDNA文库中肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4的已知序列设计合成一对特殊引物,进行PCR技术扩增目的 基因,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在CaCl2制备的感受态大肠埃希茵BL21/DE3中经过异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导目的 基因表达,表达产物经过十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.由于蛋白在包涵体表达,故通过N-十二烷基肌氨酸钠(SKL)法纯化获得纯化重组蛋白并用蛋白印迹(Western-blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明,pET-28a(十)-Arp2/3重组质粒构建成功.SDS-PAGE结果表明,基因在大肠埃希菌BL21/DE3包涵体中表达,经过包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析方法获得高纯度蛋白.重组蛋白能识别亚洲牛带绦虫患者及牛带绦虫患者血清,表明该蛋白具有免疫反应性.结论 成功克隆亚洲牛带绦虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4基因,表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

医学物理学实验教学改革实践与讨论

物理学是一门实验科学,任何物理理论的发现、建立、验证都必须以严格的科学实验作为基础,医学物理学的实验性显得尤为重要。在传统医学物理学实验教学中,教师要花费大量的时间进行理论知识及实验步骤的讲解,学生按照老师讲解做实验,这种做法违背了实验课的操作性本质。2007年,在实验教学中对教学方式进行改革,通过积极心理暗示与施加适当压力,充分激发学生实践的主动性和积极性,使实验课真正成为能让学生自己动手操作、动脑思考的课程。