血管内皮前体细胞与肿瘤血管发生

实体肿瘤的生长和演进依赖于肿瘤血管生成。肿瘤血管生成包括血管新生(angiogenesis)和血管发生(vasculogenesis),内皮前体细胞(endothelial progenitor cells,EPC)参与的肿瘤血管发生在肿瘤血管生成中起主要作用。EPC来源主要包括骨髓来源的EPC、血管壁定留EPC和成体干细胞经血管内皮分化形成的EPC,不同来源EPC参与的血管发生过程在肿瘤血管生成中起重要作用。其中,肿瘤干细胞作为肿瘤血管内皮前体细胞新来源的认识为研究肿瘤血管发生提供了新的思路。     

小鼠支气管肺泡干细胞miRNAs表达谱的鉴定

[目的]检测并验证正常成年小鼠肺内支气管肺泡干细胞（BASCs）的miRNAs表达情况。[方法]流式细胞仪分选小鼠BASCs和其对照细胞（CD45-CD31-Sca-1-CD34-细胞）;将分选出的细胞常规提取RNA后,经YM-100（Millipore）微离心过滤柱抽提小于300核苷酸长度的小RNA;微阵列法检测BASCs和其对照细胞的miRNAs表达谱,筛选出差异miRNAs;构建miRNAs特异性TaqManMGB探针,qRT-PCR法验证所选差异miRNAs在两种细胞的表达。[结果]微阵列法检测显示BASCs和对照细胞有116个miRNAs的表达有显著性差异（P〈0.01）,其中有56个miRNAs在BASCs高表达,60个miRNAs在BASCs低表达。在这些差异miRNAs中选取了10个与细胞周期、干细胞分化、肿瘤发生相关的miRNAs,通过qRT-PCR法检测其在BASCs和对照细胞中的表达,qRT-PCR的检测结果与miRNAs芯片检测结果一致。[结论]研究通过微阵列法鉴定了小鼠BASCs的miRNAs表达谱,与对照细胞相比,发现116个miRNAs的表达具有显著性差异（56个高表达,60个低表达）。     

壳聚糖纳米颗粒作为基因载体的初步研究

目的:采用适当粒径大小的壳聚糖纳米颗粒(CS-NP)连接质粒DNA,观察CS-NP结合DNA的能力及介导基因转染的效率.方法:利用静电吸附作用连接CS-NP与报告基因pEGFP-N1,形成pEGFP-N1-CS-NP复合物.用透射电镜及激光粒度分析仪观察pEGFP-N1-CS-NP的形态、粒径大小、分布及Zeta电位.用琼脂糖凝胶电泳分析CS-NP与DNA结合能力,以比色法检测其包封率;用DNase I消化实验观察pEGFP-N1-CS-NP抗核酸酶降解的能力.体外转染A549细胞观察pEGFP-N1-CS-NP的转染活性.结果:激光粒度分析仪及透射电镜观察到pEGFP-N1-CS-NP呈较均匀的不规则球形,平均粒径约为100～200nm,Ztea电位为16～22.8mV.WCS-NP/WDNA≥4时,能有效地结合DNA,包封率＞90%.CS-NP能有效介导pEGFP-N1转染A549细胞,并在A549细胞中表达绿色荧光蛋白.结论:CS-NP能有效地与质粒连接,并有很高的包封率,能保护DNA免受核酸酶的降解.CS-NP在体外能将报告基因转染入细胞内,并在细胞内表达.这些研究结果为采用CS-NP作为基因载体应用于活细胞及活体成像的研究奠定了基础.     

小鼠支气管肺泡干细胞的培养鉴定和分选

目的对正常成年小鼠肺内支气管肺泡干细胞(bronchoalveolar stem cell,BASC)进行克隆培养、鉴定和流式细胞仪分选。方法用胶原酶和分散酶联合消化小鼠肺组织制备肺单细胞悬液,并经免疫磁珠分选Sca-1+细胞;胶原蛋白和小鼠Swiss-3T3成纤维细胞系包被培养板;无血清乳腺上皮细胞培养基培养Sca-1+细胞;双重免疫荧光染色Clara细胞抗原(CCA)和肺泡表面活性蛋白C(SP-C)鉴定BASC,并用流式细胞仪分选BASC。结果通过胶原酶和分散酶联合消化小鼠肺组织,平均每只成年小鼠可得到有核细胞总数(1.6~1.8)×107;经磁珠分选后的Sca-1+细胞纯度明显高于未经分选的肺Sca-1+细胞[分别为(87.3±5.9)%、(9.6±1.8)%,P<0.05];在无血清乳腺上皮细胞培养基中Sca-1+细胞在第4天可形成BASC克隆和其他不表达CCA、SP-C的细胞克隆;流式细胞仪检测CD45-CD31-Sca-1+CD34+细胞占肺细胞总数的0.7%~1.1%,根据此分子标记能够分选出高纯度的BASC。结论通过胶原酶和分散酶联合消化,免疫磁珠分选的Sca-1+细胞在无血清乳腺上皮细胞培养...     

CD133在人NSCLC组织和细胞系中表达的初步研究

目的观察经典的肿瘤干细胞标记分子CD133在人NCSLC组织和肺癌细胞系中的表达情况。方法用CD133多抗经免疫组化染色观察12例不同类型NSCLC组织中CD133的表达,经免疫荧光染色观察CD133在H446、SPC-A1肺癌细胞中的表达。用AC133单抗经流式和激光共聚焦观察人NSCLC组织、肺癌细胞系中糖基化CD133抗原(AC133抗原)的免疫活性。结果CD133多抗染色发现CD133在NSCLC组织、正常肺组织、H446细胞和SPC-A1细胞中普遍表达。AC133单抗染色发现不同类型NSCLC组织均有少量AC133( )细胞,而在H446、SPC-A1肺癌细胞及正常肺组织中未检测到AC133( )细胞。结论不同类型NSCLC组织中有少量的AC133( )细胞,为深入研究肺癌发生、发展的分子机制提供了新的靶点。     

小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养和鉴定

目的:建立一套可靠的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)分离、纯化和培养技术,为进一步研究小鼠支气管肺泡干细胞(BASC)的增殖、分化及其在肺腺癌发生中的作用奠定基础。方法:采用分散酶消化小鼠肺组织块,经免疫黏附法纯化小鼠AECⅡ,并进行原代培养。用SP-C和CCSP免疫荧光染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果:该方法所获得细胞产量大、纯度高。AECⅡ比例约为(80±2.6)%(n=5),Clara细胞约(6.7±1.2)%(n=5),并能维持培养3~5 d。透射电镜观察AECⅡ,细胞内可见板层小体。结论:该方法是一种可靠的小鼠AECⅡ的分离、纯化和培养技术,可满足一般的实验要求。     

Anti-miR-155反义寡核苷酸对人肺鳞癌H157细胞增殖的影响

目的：观察anti-miR-155反义寡核苷酸（AMOs）对肺鳞癌H157细胞增殖的影响。方法：将H157细胞分为对照组和AMOs处理组，AMOs处理组采用AMOs抑制H157细胞内miR-155的活性，液闪计数仪测定[^3H]-TdR掺入量，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。结果：与对照组相比，AMOs显著减少H157细胞[^3H]-TdR掺入量（P〈0．01），随着浓度从10nmol／L逐渐增加至于100nmol／L，H157细胞[^3H]-TdR掺入量亦随之减少（P〈0．01）；AMOs显著抑制H157细胞的增殖（P〈0.01），使G0／G1细胞比例显著增加，G2／M期细胞比例显著减少（P〈0．01）。结论：AMOs通过抑制H157细胞内高水平表达miR-155的活性，显著抑制H157细胞的增殖。     

Anti-miR-155反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的观察anti-miR-155反义寡核苷酸（AMOs）对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法 A549细胞分为对照组和AMOs处理组，采用AMOs抑制A549细胞内miR-155的活性，液闪计数仪测定[3^H]-TdR掺入量，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。结果与对照组相比，AMOs显著减少A549细胞[3^H]-TdR掺入量，随着浓度从10nmol/L逐渐增加至100nmol/L，A549细胞[3^H]-TdR掺入量亦随之减少。MTT法测定细胞增殖抑制率结果显示，与对照组相比，AMOs显著抑制A549细胞的增殖。流式细胞术检测结果显示AMOs使G0/G1细胞比例显著增加，G2/M期细胞比例显著减少。结论采用AMOs抑制A549细胞内高水平表达miR-155的活性后，可显著抑制A549细胞的增殖。     

双重免疫荧光染色法鉴定肺组织内CCA+SP-C+细胞

目的：通过双重免疫荧光染色法鉴定不同肺组织内是否存在Clara细胞特异性抗原（Clara cell specific antigen，CCA）和肺泡表面活性蛋白C（surfactant protein C，SP—C）共表达的双阳性细胞（double positive cell，DPCs）CCA^＋SP-C^＋细胞，为后续开展肺干细胞的相关研究提供实验基础。方法：取成年鼠（小鼠、大鼠）和新生鼠（小鼠、大鼠）的正常肺组织，人的肺鳞癌、腺癌的癌组织和癌旁组织，冰冻切片，进行双重免疫荧光染色，通过激光扫描共聚焦显微镜观察肺组织内是否存在DPCs。每例标本观察时镜下随机选择4—6个视野，计数100～200个肺细胞，得出每百个细胞内DPCs百分率，采用SPSS 11．0统计软件包对数据进行分析。结果：在成年鼠和新生鼠的正常肺组织中均发现了DPCs的存在，在人的肺腺癌组织中也发现了DPCs，而在鳞癌组织中未见DPCs；在人的癌旁组织DPCs数量明显多于相对应的癌组织（P〈0．05）。结论：本研究不仅证实了DPCs细胞存在的广泛性，而且在人的肺腺癌组织中发现了DPCs，同时发现癌旁组织内的DPCs明显多于癌组织，为后续进一步分离、纯化DPCs，研究正常肺干细胞和肺癌干细胞的生物学特性提供了实验基础。