乙型肝炎病毒感染不同阶段患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的测定

目的 测定HBV感染不同阶段患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的频率及标记分子,并分析其与临床指标的相关性.方法 采集79例慢性乙型肝炎(CHB)、12例急性乙型肝炎(AHB)患者、26例无症状HBV携带者(ASC)和20例健康对照的外周血,流式细胞仪分析Treg频率、Treg细胞表面和胞内特征性分子的表达.普通RT-PCR和相对荧光定量PCR测定叉头/翼状转录因子3(Foxp3)在CD25+Treg细胞的表达水平.所有患者及健康对照均经ELISA检测HBV血清标记物水平,实时荧光定量PCR测定血清HBV DNA载量,并进行肝功能检测.结果 总CD4+CD25+T细胞占外周血CD4+T细胞的比率,在各患者组和健康对照组之间差异均无统计学意义(P＞0.05).HBeAg阳性CHB组CD4+CD25高表达T细胞频率(3.42%±0.81%)与HBeAg阴性CHB组(3.19%±0.67%)、ASC组(3.05%±0.64%)比较,差异无统计学意义(均P＞0.05),但明显高于健康对照组(2.72%±0.71%,P=0.034)和AHB组(2.25%±0.54%,P=0.013).CD4+CD25高表达T细胞表面高表达CD45RO、CD25分子,低表达CD45RA,细胞内高表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和Foxp3.各患者组及健康对照组Treg中Foxp3表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05).CHB组患者的Treg频率与血清病毒载量呈正相关(r=0.48,P=0.018).结论 Treg可能通过抑制T细胞免疫应答反应而影响病毒清除,并与CHB患者的持续感染密切相关.     

HBV感染患者外周血T细胞PD-1基因表达水平的变化与意义

目的:分析HBV感染不同阶段患者外周血T淋巴细胞中PD-1(program death factor-1)分子的基因定量表达情况,探讨PD-1表达水平与血清学指标的相关性。方法:采集并筛选HLA-A2阳性的31例慢性乙型肝炎(CHB)患者、9例急性恢复期乙型肝炎患者(AHB)、15例乙肝相关性肝硬化患者(LC)和10例健康献血者的外周血,实时荧光定量PCR分析总T细胞内PD-1的mRNA水平,同时测定其配体PD-L1、PD-L2在外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标记物水平,荧光定量PCR检测血清HBV DNA载量,同时进行肝功能检测。结果:以各基因在正常对照组的定量表达水平为基础值,HBeAg阳性CHB组T细胞内PD-1和PBMCs内PD-L1的mRNA表达水平明显升高,与HBeAg阴性CHB组和AHB组比较均有显著性差异,但与LC组比较无统计学意义(P>0.05)。外周血PBMCs内PD-L2的mRNA水平在各实验组中无明显差异(P均>0.05)。在所有检测的CHB患者中,外周血T细胞内PD-1表达水平在高病毒载量组(HBV DNA≥107拷贝/ml)明显高于低病毒载量组(HBV DNA<107拷贝/ml)和正常对照组,且与血清HBV病毒载量成正相关(r=0.41,P<0.01),但与血清ALT水平无明显相关性。结论:外周血T细胞中PD-1基因水平在慢性乙型肝炎患者组,尤其是在HBeAg阳性组和高病毒载量组明显上调,提示T细胞高表达的PD-1可能通过与其配体PD-L1作用而抑制T细胞免疫应答,并导致病毒持续感染。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞PD-L1表达的相关研究

目的：探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞（DCs）的PD—L1表达水平，及其对DCs刺激T细胞增殖的影响。方法：采集22例慢性HBeAg阳性CHB患者、8例急性恢复期乙型肝炎（AHB）患者和10例健康人（NC）的外周血，分离单个核细胞（PBMC）并诱导DCs的增殖和活化。相对荧光定量PCR测定DCs的PD—L1、PD—L2分子mRNA水平，流式细胞术测定DCs表面PD—L1和PD—L2的表达率。同时，测定外周血DCs刺激同种异体反应性T细胞增殖的能力，及抗PD—L1单抗对CHB组DCs刺激功能的影响。结果：体外成功诱导了外周血DCs的增殖和成熟。与NC组相比较，CHB组和AHB组患者外周血DCs内PD—L1的mRNA水平均显著增高（P均〈0．05），但CHB组和AHB组间差异无统计学意义。CHB组患者外周血DCs表面PD—L1表达率较AHB组、NC组均有明显增高（P均〈0．01）。而外周血DCs的PD—L2 mRNA水平及PD—L2在DCs表面的表达率在各实验组之间无明显差异（P均〉0．05）。CHB组外周血DCs刺激T细胞增殖的功能较AHB组和NC组明显降低（P均〈0．01），抗PDL1抗体能显著增强CHB患者DCs刺激T细胞反应的能力。CHB患者外周血DCs表面PD—L1表达率与血清HBV病毒载量成正相关（r=0．34，P=0．007）。结论：外周血DCs表面PDL1表达水平在慢性HBeAg阳性乙肝患者明显升高，抗PD—L1抗体可有效增强CHB患者外周血DCs刺激T细胞增殖反应的能力，表明PD—L1的高表达可能与T细胞免疫反应低下和HBV病毒高复制密切相关。     

基于悬浮芯片技术的56种病原微生物的高通量检测

目的:建立高通量、快速、可靠、经济的病原微生物诊断技术平台。方法:设计和合成针对56种常见病原微生物的探针和阳性对照,采用悬浮芯片技术,对56种病原微生物的阳性标准品进行检测。结果:56种标准品的检测值显著高于阴性对照,各病原微生物的阳性标准品和各探针之间无交叉反应。结论:建立了高通量、快速、可靠、经济的病原微生物诊断技术平台,为突发传染病的病原体诊断提供技术储备。     

黄芪多糖和黄芪总甙调控LX-2细胞因子分泌

目的:用黄芪多糖和黄芪总甙对LX-2细胞分泌的与纤维化相关的主要细胞因子进行研究,以探讨黄芪抗纤维化的确切分子机制。方法:不同浓度的黄芪多糖和黄芪甙作用于LX-2细胞,以Real Time Cell Electronics Sensing技术实时检测细胞增殖状态;分别再以25μg/ml和300μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙作用LX-2细胞24 h,提取细胞mRNA,以荧光定量PCR测定转化生长因子1(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA的变化。结果:300μg/ml的黄芪多糖可抑制LX-2的增殖(P<0.05,94.7 h),但不同浓度的黄芪总甙对LX-2细胞均有促进增殖的作用(P<0.05);25μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙在TGF-β1促进分泌的同时,也上调其它抗纤维化因子,其中黄芪多糖对MMP2的上调(104.9倍)、黄芪总甙对IL-10的上调(550.65倍)最为显著;300μg/ml的黄芪多糖可抑制TGF-β1及HGF、MMP9、IL-10的表达,但仍然上调MMP2的表达,300μg/ml的黄芪总甙也可抑制TGF-β1的表达,但对抗纤维化因子MMP2、MMP9及IL-10仍有明显的上调作用。结论:低浓度(25μg/ml)和高浓度(300μg/ml)的黄芪多糖和黄芪总甙可通过不同的分子机制调控肝星状细胞因子的分泌而发挥抗纤维化作用;黄芪多糖主要以促进MMP2分泌为主,而黄芪总甙则主要通过上调MMP2、MMP9及IL-10的分泌而发挥作用。高剂量的黄芪多糖和总甙抗纤维化效果优于低剂量组。