人白介素24腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建人白介素24（hIL-24）的腺病毒载体，获得hIL-24重组腺病毒子，为hIL-24进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-hIL-24重组质料为模板，PCR扩增hIL-24，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack—CMVR质粒上，PmeI线性化重组质粒pAdTrack—CMV-hIL-24，与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hIL-24，经Pacl线性化后转染QBI-293A包装细胞。收获腺病毒重组病毒子，RT-PCR和Western—blotting鉴定。结果测序结果显示hIL-24序列正确，RT—PCR和Western-blotting检测到了hIL-24的表达。结论成功构建人白介素24的重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack，CMV—hIL-24。获得了人白介素24重组病毒子Ad-hIL-24。     

rhLIF与IL-24基因协同诱导HL-60细胞的凋亡

目的：构建能稳定表达白血病抑制因子（LIF）的转基因细胞,并研究所表达的LIF与IL-24基因在诱导HL-60细胞凋亡方面的协同作用。方法：用真核表达质粒pcDNA3-LIF转染ECV304细胞,G418筛选阳性细胞,收集阳性细胞和培养上清,RT-PCR检测LIFmRNA的表达。同时在已转化重组腺病毒质粒的大肠杆菌中抽提质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL-24,用PacI酶切使重组腺病毒质粒线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,收获Ad-IL-24腺病毒子。将重组病毒子（Ad-IL-24）感染HL-60细胞,同时加入含LIF的培养上清,并设对照组,RT-PCR检测IL-24 mRNA表达,光镜下观察HL-60细胞形态的变化,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫细胞化学分析凋亡因子的改变。结果：成功构建能稳定表达LIF蛋白的转基因细胞;获得高滴度的重组腺病毒Ad-IL-24,用它感染HL-60细胞后,能检测到IL-24 mRNA的表达。各种检测方法表明LIF、IL-24基因都能抑制HL-60细胞生长、诱导凋亡,且两者具有协同作用。结论：LIF、IL-24基因都能抑制HL-60细胞生长,诱导凋亡,两者具有协同作用。     

人IL-24重组蛋白免疫刺激及血管形成抑制作用

目的 探讨人重组白细胞介素-24(rhIL-24)蛋白体外免疫刺激功能和血管形成抑制作用.方法 将原核稳定表达得到的rhIL-24蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC),ELISA检测其刺激免疫细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及γ-干扰素(IFN-γ)的活性;利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型观察rhIL-24蛋白抑制血管形成的效应.结果 rhIL-24蛋白孵育的PMBC在不同时段分泌的IL-6、TNF-α及IFN-γ浓度与阴性对照组相比存在显著差异;rhIL-24蛋白能明显抑制CAM二级和三级血管形成,与阴性组比较,差异极显著.结论 rhIL-24蛋白具有明显的免疫刺激功能和血管形成抑制作用.     

mING基因的腺病毒载体的构建与表达

目的构建鼠ING4（肿瘤生长抑制因子4）的腺病毒载体，获得鼠ING4（mING4）重组腺病毒子，为ING4进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-mING4重组质粒为模板，PCR扩增miNG4，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV质粒上，PmeI线性化重组质粒pAdTrack-CMV-mING4，与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒表达载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-mING4，经PacI线性化后转染293细胞，收获腺病毒重组病毒子，RT-PCR鉴定，并用MTT法检测mING4对肝癌细胞SMMC7721的作用。结果成功构建mlNG4的重组腺病毒表达载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-mING4，获得了mING4重组病毒子。结论mING4的重组腺病毒表达载体可抑制SMMC7721细胞的生长。     

人重组白细胞介素24和表没食子儿茶素没食子酸酯对肿瘤血管生成的影响

目的 观察人重组白细胞介素24(rhIL-24)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对组织新生血管和肿瘤组织血管生成的影响并作比较.方法 在鸡胚模型上比较观察rhIL-24、EGCG对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响,在人肺腺癌裸鼠移植瘤模型上比较观察两者对肿瘤组织生长、组织中CD34和NF-κB(p50)的表达影响.结果 rhIL-24、EGCG均可抑制CAM上Ⅱ、Ⅲ级血管的生成.rhIL-24组瘤体组织中NF-κB(p50)的表达与PBS组比较有显著性差异,而EGCG组则不明显;rhIL-24组和EGCG组瘤体组织中CD34标记的微血管密度,与PBS组比较均有显著性差异.结论 rhIL-24、EGCG都有抑制CAM血管生成和肿瘤组织血管生成的作用,对肿瘤组织中NF-κB表达可能存在不同影响,推测两者或许存在不同的抗肿瘤血管生成机制.     

生物类基因治疗载体的研究新进展

自1990年French等把腺嘌呤脱氨酶基因成功导入到一名4岁小女孩的T淋巴细胞中治疗了腺嘌呤脱氨酶基因缺失病,开创了人类利用人体基因治疗疾病的先例。与此同时,我国于1992年由复旦大学薛京伦为首的课题组首次把人凝血因子Ⅸ基因成功用于治疗血友病。十多年来全世界已完成500多例     

裂解型腺病毒Ad-E1A的构建以及体外对肝癌细胞的作用

目的 构建Ad-E1A裂解型腺病毒载体,研究其对肝癌细胞的裂解作用.方法 以QBI-293A细胞基因组DNA为模板,用特异性引物PCR法扩增E1A基因,酶切后连接到pAdTrack-CMV转移质粒上,用PmeI酶对pAdTrack-CMy-E1A线性化后,与pAdEasy-1共转化在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-E1A;再用PacI酶切对重组腺病毒质粒线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,收获Ad-E1A腺病毒子.在QBI-293A细胞中多轮感染后获得高效价的病毒.将Ad-EIA腺病毒感染SMMC-7721,并用MTT和流式细胞仪检测Ad-E1A对人肝癌细胞生长和细胞周期的影响.结果 获得高滴度的重组裂解型腺病毒Ad-E1A.Ad-E1A感染SMMC-7721后,出现明显的细胞病变.Ad-E1A对人肝癌细胞SMMC-7721的生长有明显抑制,48 h后效果明显.Ad-E1A可直接诱导SMMC-7721细胞的凋亡.结论 裂解型腺病毒Ad-E1A构建成功并可以显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生长,并在肝癌细胞中复制造成细胞裂解,诱导肝癌细胞的凋亡.     

腺病毒载体介导的人IL-24基因对HL-60白血病细胞体外培养的影响

目的 构建人IL-24的腺病毒载体Ad-IL24,观察Ad-IL24对HL-60细胞体外培养的影响.方法 以pcDNA3.0-IL24重组质粒为模板PCR扩增IL-24基因,酶切并连接到带有绿色荧光蛋白(GFP)标记的pAdTrack-CMV质粒上,Pme Ⅰ线性化重组质粒pAdTrack-CMV-IL24,并与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL24,经Pac Ⅰ线性化后转染QBI-293A细胞,收获重组病毒Ad-IL24.将它感染HL-60细胞,通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)、MTT和流式细胞术(FCM)法检测IL-24对HL-60细胞生长的影响,免疫细胞化学分析凋亡因子的改变,ELISA检测重组病毒对HL-60细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响.结果 成功构建重组腺病毒载体pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL24并获得高滴度的重组腺病毒Ad-IL24,各种检测方法表明IL-24基因能抑制HL-60细胞生长,诱导凋亡,IL-24还能下调HL-60细胞Bcl-2的表达并刺激它分泌二级细胞因子IFN-γ和TNF-α.结论 IL-24能抑制HL-60细胞生长、诱导凋亡,它可通过下调HL-60细胞Bcl-2的表达并刺激其分泌具有抗肿瘤活性的二级细胞因子来发挥效应.     

重组人白细胞介素24对肺癌A549细胞生长和肿瘤血管生成影响的实验研究

白细胞介素24（IL-24）即黑色素瘤分化相关基因7（mda-7），除具有免疫刺激应答功能外，还有抑制肿瘤细胞生长、促进其凋亡和抑制肿瘤血管生成的作用，被认为是一种新的抑癌基因。本研究观察了pET-21a-IL-24重组质粒表达系统的表达产物——部分纯化人重组IL-24（rhlL-24）蛋白，在体内外对肺癌A549细胞、瘤体生长的抑制作用和抗肿瘤血管生成作用。