CD4+CD25+调节性T细胞的体外扩增

 【目的】 探讨有效的体外培养扩增CD4+CD25+Treg的方法。【方法】 收集健康志愿者外周血5例，免疫磁珠法分选出CD4+CD25+Treg。将实验分为三组，第一组在CD4+CD25+Treg中加入100 nM rapamycin (1μg/ml)和包被了CD3/CD28单抗的磁珠培养3周，第8 天开始加入1000U/mL的IL-2，第二组培养条件除不加rapamycin外其余与第一组相同，第三组培养细胞为CD4+CD25-T细胞，培养条件同第一组。培养第7、14、21天收集细胞计数，第21天收集细胞行流式细胞术三标法检测CD4、CD25、FOXP3的表达。MTT法检测体外扩增的CD4+CD25+Treg对自体和异体的CD4+T细胞增殖的抑制作用。 【结果】 三组细胞均有明显的扩增，加rapamycin培养的CD4+CD25+Treg细胞的扩增率比不加rapamycin扩增倍数低，但细胞的纯度明显增加。CD4+CD25-T细胞组在培养第一周扩增迅速，从第二周开始增殖减慢，CD4+CD25+ Treg 细胞的比例较培养前无明显的差别。三组至第三周时扩增倍数分别为 89.4+20.53、338.4+77.64 、215.6+54.58（F=484.655,p<0.0001），细胞的纯度分别为84.32+4.62%、34.04+5.78%、0.68+0.39% (F=24.660,p<0.0001)。体外抑制实验显示体外扩增的CD4+CD25+T细胞对自体和异体的CD4+T细胞增殖均有明显的抑制作用，并且随着效靶比浓度的降低而降低。在CD4+T/Treg比例为8：1、4：1、2：1、1：1时对自体CD4+T细胞的抑制率分别为9.65%、16.43%、28.75%、55.34%，对异体CD4+T细胞的抑制率分别为6.43%、14.72%、26.47%、50.25%，而且在各浓度梯度其抑制作用在自体和异体之间均无明显的差异。结论 我们采用rapamycin+CD3/CD28单抗标记的磁珠+IL-2在体外成功扩增了CD4+CD25+Treg，其扩增的倍数为89.4+20.53，具有免疫抑制功能，有望进一步应用于临床。     

CPP-Id体外冲击DC对CTL增殖及杀伤活性的诱导作用

背景与目的:树突状细胞(dendritic cell,DC)作为一种专职的抗原提呈细胞,能激活并刺激初始(na-ive)T淋巴细胞抗击外来微生物及肿瘤,在诱导免疫应答中起着特殊的作用。本研究通过体外检测不同抗原负载的DC刺激小鼠TC的增殖、诱导肿瘤特异性CTL分泌INF-γ的量以及对A20细胞的杀伤实验,探讨DC体外活化TC的效应。方法:混和淋巴细胞反应(MLR)用MTT法检测不同抗原负载后的DC体外刺激同种异体淋巴细胞的增殖率;LDH法检测不同抗原负载后的DC诱导同种异体CTL的特异性杀伤活性;ELISPOT法检测活化的TC分泌INF-γ的能力。结果:在DC∶TC=1∶10时,CPP-Id-DC-TC(320%±15%)的增殖率明显高于Id-DC-TC(57%±10%)(P<0.005);CPP-Id-DC-TC对A20细胞的杀伤率(58%±10%),明显高于其对B16细胞(8.2%±1.2%)(P<0.001)及Id-DC-TC对A20细胞的杀伤率(21.6%±8.6%)(P<0.005);CPP-Id-DC-TC组产生的斑点数(96±8)个比Id-DC-TC组(31±6)个及单纯TC组(9±2)个产生的斑点数明显增加,差异有显著性(P<0.01)。结论:CPP-Id体外冲击DC后,可以诱导CTL的增殖及杀伤活性增强。     

CD8+CD28-Ts、CD3+CD56+NKT细胞在B细胞非霍奇金淋巴瘤患者外周血中分布的分析

背景及目的:目前认为B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)常伴随免疫抑制,CD8 CD28-Ts(Ts)细胞和CD3 CD56 NKT(NKT)是新鉴定的新型免疫抑制性调节细胞,在肿瘤的免疫抑制及免疫逃逸机制中起重要作用,但它们在B细胞淋巴瘤患者外周血的分布情况及其免疫抑制中的作用目前尚不清楚。本文通过分析两者在化疗前及化疗后B-NHL患者外周血中比例及变化规律,初步探讨它们在B-NHL的免疫抑制作用及其影响因素,为有效干预患者的免疫功能提供参考。方法:应用流式细胞仪检测79例治疗前的B-NHL患者、经4～6周期化疗后完全缓解(CR)的18例患者、30例健康志愿者外周静脉血中NKT及Ts细胞的比例。结果:在79例治疗前B-NHL患者的外周血中,Ts细胞比例为(18.19±5.03)%,较正常对照组(11.20±3.49)%明显增高(P<0.01);NKT的比例为(6.08±3.29)%,亦较正常对照组的(3.52±1.56)%明显增高(P<0.01)。Ts在不同临床分期的患者之间无显著性差异P>0.05;Ⅰ期为(17.56±4.10)%、Ⅱ期为(18.05±5.64)%、Ⅲ期为(18.14±5.58)%、Ⅳ期为(18.95±4.64)%;在不同恶性程度的患者之间亦无显著性差异P>0.05;低度恶性为(17.81±5.24)%、中度恶性为(18.37±4.83)%、高度恶性为(18.31±5.93)%;在治疗前(18.64±4.55)%和CR后(19.42±4.95)%患者之间亦无显著性差异(P=0     

核因子-κＢ在三阴性乳腺癌中的表达及其意义

目的　探讨核因子-κＢ（ＮＦ-κＢ）在三阴性乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法　应用免疫组化法ＰＶ-６０００二步法检测１３７例三阴性乳腺癌和１３２例非三阴性乳腺癌患者癌组织ＮＦ-κＢ的表达,分析其与临床病理特征和预后之间的关系。结果　１３７例三阴性乳腺癌组织中的ＮＦ-κＢ阳性表达率为７３.７％（１０１／１３７）,明显高于非三阴性乳腺癌的４６.２％（６１／１３２）,差异有统计学意义（Ｐ＝０.０００）。在１３７例三阴性乳腺癌中,ＮＦ-κＢ表达与ＶＥＧＦ、ｐ５３、组织分级、淋巴结转移、５年无病生存率和５年总生存率有关（Ｐ＜０.０５）;而在１３２例非三阴性乳腺癌中,ＮＦ-κＢ表达仅与ＶＥＧＦ、淋巴结转移、５年无病生存率相关（Ｐ＜０.０5）。结论　ＮＦ-κＢ在三阴性乳腺癌中表达率高,并可作为三阴性乳腺癌的预后指标。     

三阴乳腺癌的临床病理特征和预后分析

背景与目的:三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是一类高危乳腺癌,其雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone,PR)和入表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2.Her-2)表达均为阴性,因而不能从针对激素受体的内分泌治疗和Her-2的靶向治疗中获益.本研究旨在分析TNBC患者的临床病理特征、生存情况和预后影响因素.方法:收集免疫组织化学检测ER、PR和Her-2均为阴性的128例乳腺癌患者的临床病理资料,观察其长期生存情况.结果:所有患者中,浸润性导管癌占89.0%.T1、T2患者占78.1%,有淋巴结转移的患者占48.4%,Ⅰ、Ⅱ期患者占60.9%.5年无病生存率、无局部复发生存率、无远处转移生存率和总生存率分别为71.1%、84.3%、75.8%和83.6%.单因素分析结果显示,淋巴结转移、肿块大小、分期和脉管癌栓与TNBC预后有关.多因素分析显示,淋巴结转移(RR=17.449,P=0.000)、原发肿块大小(RR=31.237,P=0.000)是影响TNBC预后的因素.结论:TNBC有明显不同的临床病理特征,发病时常年轻、有淋巴结转移、肿块较大,有乳腺癌家族史,预后差,淋巴结转移和肿块大小是影响TNBC预后的因素.     

R-CHOP和CHOP方案治疗两种亚型弥漫大B细胞淋巴瘤患者的近期疗效

背景与目的：根据肿瘤细胞起源不同,可将弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuselarge Bcelllymphoma,DLBCL）分为生发中心来源（germinalcenter Bcell like,GCB）及非生发中心来源（non-GCB）两种亚型。在以CHOP方案为标准的化疗基础上,前者预后优于后者。本研究通过比较R-CHOP（Rituximab联合CHOP）和CHOP方案治疗不同亚型DLBCL患者的近期疗效,寻找初诊DLBCL患者最佳一线治疗方案。方法：将2006年11月至2008年2月中山大学肿瘤防治中心内科收治的83例初治DLBCL患者分为GCB和non-GCB两组。按照修订版淋巴瘤疗效评价标准,比较接受R-CHOP或CHOP方案治疗患者的近期疗效;观察Bcl-2在两种亚型中的表达情况,并分析其与近期疗效的关系。结果：83例DLBCL患者中GCB组35例（42．2％）,non-GCB组48例（57．8％）。GCB组一线化疗近期总缓解率74．3％,non-GCB组60．4％,两组相比差异有显著性（P=0．006）。Bcl-2在GCB和non-GCB两亚组的表达差异没有显著性：Bcl-2阳性患者采用R．CHOP方案治疗的近期缓解率（75．6％）明显高于用CHOP方案治疗者（47．8％）,两组相比差异有显著性（P=0．031）：采用不同方案化疗的Bcl-2阴性患者的近期缓解率则差异无显著性（P〉0．05）。结论：GCB组患者接受标准R—CHOP或CHOP方案治疗近期缓解率高于non-GCB组,提示预后良好。加用Rituximab可提高Bcl-2阳性患者的近期缓解率。     

冻干人胎盘因子(PF)对肿瘤放疗不良反应和疗效的影响

冻干人胎盘因子（PF）是从健康人胎盘中直接提取的生物活性物质，临床前研究提示具有调节或增加机体免疫功能，促进造血功能恢复及激活巨噬细胞活性等多种生物作用。临床预试验的结果显示：该药无明显毒性反应，对肿瘤放、化疗患者具有稳定外周血象，提高细胞免疫功能及减轻放、化疗的毒副反应等作用。为进一步评价其安全性及有效性，经卫生部药品审评中心[（1997）卫药审中字第001号文]批准，进行Ⅱ期临床试验研究。本项研究的目的是考察PF对放疗患者不良反应、免疫功能、生活质量以及客观疗效的影响。     

儿童肾母细胞瘤的诊断与治疗

肾母细胞瘤,又称为威尔姆斯瘤(Wilms’tumor,WT),是儿童最常见的泌尿生殖系统胚胎性恶性肿瘤[1]。临床一般表现为无症状的腹部肿块,通常在父母或护理人员为儿童洗澡、穿衣时触及,腹痛、肉眼血尿、发烧等症状可在就诊时发现,同时,约20%患儿有高血压表现[2]。WT生长迅速、恶性程度高、发生转移早,常血行转移至肺和肝脏[3]。WT可双侧发病,超过12%的WT合并有不同类型先天性疾病,例如:睾丸下降不全、尿道下裂、偏身肥大、虹膜缺如[4]。全球先天性畸形的发病率为17.6%[5],而与肾母细胞瘤相关先天畸形的比例占8%~17%[6]。     

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的体外扩增

【目的】探讨有效的体外培养扩增CD4^＋CD25^＋Treg的方法。【方法】收集健康志愿者外周血5例，免疫磁珠法分选出CD4^＋CD25^＋Treg。将实验分为3组，第1组在CD4^＋CD25^＋Treg中加入100nmol／L rapamycin（1μg／mL）和包被了CD3／CD28单抗的磁珠培养3周，第8天开始加入1000U／mL的IL．2，第2组培养条件除不加rapamycin外其余与第1组相同，第3组培养细胞为CD4^＋CD25^＋细胞，培养条件同第1组。培养第7、14、21天收集细胞计数，第21天收集细胞行流式细胞术三标法检测CD4、CD25、FOXP3的表达。MTY法检测体外扩增的CD4^＋CD25^＋Treg对自体和异体的CD4^＋T细胞增殖的抑制作用。【结果】三组细胞均有明显的扩增。加rapamycin培养的CD4^＋CD25^＋Treg细胞的扩增率比不加rapamycin扩增倍数低，但细胞的纯度明显增加。CD4^＋CD25^＋T细胞组在培养第1周扩增迅速，从第2周开始增殖减慢，其中CD4^＋CD25^＋Treg细胞的比例较培养前无明显的差别。三组至第3周时扩增倍数分别为89&#177;21、338&#177;78、216&#177;55（F=484．655，P〈0．0001），细胞的纯度分别为84．32％&#177;4．62％、34．04％&#177;5．78％、0．68％&#177;0．39％（F=24．660，P〈0．0001）。体外抑制实验显示体外扩增的CD4^＋CD25^＋T细胞对自体和异体的CD4^＋T细胞增殖均有明显的抑制作用，并且随着效靶比浓度的降低而降低。在CD4^＋T／Treg比例为8：1、4：1、2：1、1：1时对自体CD4^＋F细胞的抑制率分别为9．65％、16．43％、28．75％、55．34％，对异体CD4^＋T细胞的抑制率分别为6．43％、14．72％、26．47％、50．25％，而且在各浓度梯度其抑制作用在自体和异体之间均无明显的差异。【结论】我们采用rapamycin＋CD3／CD28单抗标记的磁珠＋IL-2在体外成功扩增了CD4^＋CD25^＋Treg，其扩增的倍数为89．4&#177;20．53，具有免疫抑制功能，有望进一步应用于临床。     

使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点

【目的】筛选高效的foxp3 RNA干扰的靶点用于阻断CD4^＋CD25^＋ Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列，化学合成法合成4条shRNA序列，构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体：构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点。【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒；成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞：在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3％和95．6％的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。