细胞因子生物学检测技术的规范化和要点

一、概述细胞因子是一类由免疫活性细胞产生的小分子多肽或蛋白，具有维持和调控机体造血和免疫系统的生理功能。但其异常的分泌或合成能引发机体许多病理性紊乱。此外，细胞因子对多种疾病还具治疗潜力。因此，细胞因子的定性和定量检测不仅是基础免疫学中有用的研究手段，而且在医学检验中可作为衡量机体细胞免疫功能的标志，用以探讨发病的机理、判断预后和考核疗效的指标。并可对现代细胞工程技术生产的重组细胞因子进行质控，因而采用何种合适的检测方法至关重要。ＥＬＩＳＡ等免疫学检测细胞因子的方法，它能检出具有免疫原性的分子。…     

人源性抗HBsAg噬菌体抗体的筛选及纯化

目的:获得人源性抗HBsAg抗体Fab片段。方法:用预包被HBsAg的ELISA板,从构建的人全套抗体库中筛选出针对HBsAg的噬菌体抗体。并转入大肠杆菌中表达。破裂细胞后,获得可溶性Fab片段。以羊抗人Fab抗体偶联HiTrap柱,用     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

人源性抗HBs可变区单链抗体基因的构建及核酸序列测定

将通过噬菌体显示技术获得的一株人源性抗HBs Fab抗体基因重链和k轻链的可变区用编码柔性肽的Linker使其连接成单链,克隆入中间载体,并进行核酸序列测定,为其后的表达及双功能抗体的构建打下基础。     

构建分泌型HBsAg单链抗体在毕赤酵母菌中的表达研究

为了从巴氏毕赤酵母中获得分泌表达的非融合人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv ) ,设计引物从pGEM HBscFv上扩增HBscFv,亚克隆至P pastoris表达载体pPICZαA中 ,然后转化P pastorisGS115、KM71,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子 ,甲醇诱导目的蛋白表达并对其性质进行鉴定。结果发现 ,3%～ 5 %的转化子具有 2 0 0 0mg/LZeocin抗性 ;转化子诱导后 ,可以合成并分泌相对分子质量为 32 0 0 0的HBscFv ,表达量占酵母培养上清中总蛋白的 2 2 % ;酵母表达产物可被针对大肠杆菌来源HBscFv的单克隆抗体特异性识别 ,并具有结合HBsAg活性。     

人源性抗HBsAg抗体Fab段噬菌体呈现文库的构建、筛选及阳性克隆核苷酸序列测定

目的:构建一个经HBsAg主动免疫的人lgG1抗体噬菌体展示文库,通过特异的淘筛(panning)获得与HBsAg有较高亲和力的Fab抗体,并测定其编码序列。方法:从一经乙肝疫苗免疫的自愿者的外周血分离淋巴细胞提取RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA。依次将PCR产物克隆进载体pComb3H相应的位点,构建成噬菌体呈现库,并以HBsAg包被的96孔板对抗体库进行3轮淘筛,将所获克隆分别与HBsAg进行ELISA反应,挑取显色大于对照20倍以上的阳性克隆进行DNA测序。结果:lgG1的Fd段和κ轻链cDNA得到扩增,构建了一实际库容量为1.8×10⁵的噬菌体呈现文库。通过特异性淘筛,获得与HBsAg有较高新合力的3株Fab抗体并测定其编码序列。DNA序列测定结果表明,3株抗体中两株的Fd段完全一样,且3株的轻链完全一样。结论:成功构建了一个经HBsAg抗原免疫的人源抗体Fab段噬菌体抗体库,筛选得到了3株特异性抗体的Fab片段。     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化

背景：次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21）是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性。目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白。方法：取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly（I：C）刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列。克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21。将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达。CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化。结果与结论：实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白。结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白。     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化◆

背景:次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21)是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性.目的:构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白.方法:取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly(I:C)刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列.克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21.将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达.CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化.结果与结论:实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白.结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白.     

抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定

应用重叠ＰＣＲ自人源性ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段中扩增出ＶＨ、ＶＬ 基因 ,以 (Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ3)ｌｉｎｋｅｒ连接成单链抗体 ,插入表达载体ｐＱＥ 4 0 ,在大肠杆菌内获得包涵体表达。工程菌表达优化试验表明 ,在Ａ60 0 为 0 .6时开始诱导 ,持续 6ｈ ,目的蛋白表达量最高 ,达菌体总蛋白 34 .2 %。包涵体变性后以金属镍螯合柱一步纯化 ,目的峰透析复性 ,得到纯度为 97%的具有结合ＨＢｓＡｇ活性的重组单链抗体。抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定@任向荣!510602$广州解放军第四五八医院全军传染病中心 @熊盛$华南理工大学…     

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。