不同来源的人脂肪干细胞体外成脂诱导分化能力的比较

目的：对同一个体不同部位来源的脂肪干细胞体外成脂诱导分化的能力进行比较，为脂肪干细胞的进一步应用提供实验依据。 方法：实验于2004-11／2005-05在中国协和医科大学整形外科医院研究中心完成。提取5例女性临床吸脂患者（平均年龄32岁）8个部位（大腿前侧、臀上部；臀上部、上腹部；髂腰部；上腹部；背部、上臂）脂肪抽吸组织中的间充质干细胞，体外进行成脂诱导分化。在对照培养基（含体积分数0．1胎牛血清的DMEM培养基）中培养的第l代脂肪干细胞，以3&;#215;10^-4细胞／皿接种到35mm培养皿中，将对照培养基更换为成脂诱导培养基，进行成脂诱导，每周换液2次，以加入对照培养基的培养皿设为阴性对照。继续培养2周，分别取诱导后的细胞和阴性对照细胞各两皿进行油红O染色，以证实细胞中有无脂滴形成。通过油红O染色及阳性细胞记数，分别对来源于3例患者的2个不同部位的脂肪抽吸标本中的脂肪干细胞向成脂细胞分化的能力进行定性和半定量检测，采用卡方检验对不同细胞的成脂诱导分化率进行测定。 结果：①脂肪干细胞成脂诱导分化能力的测定结果：从不同个体的每100mL脂肪抽吸组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同，从2.45&;#215;10^8-／100mL-1.25&;#215;10^9个／100mL不等；但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似；根据各例细胞成脂诱导分化率，可得出5例患者8个部位细胞的平均成脂诱导分化率为36．2％。经统计学分析证实同一个体不同部位来源的细胞具有不同的成脂分化能力，获得的平均干细胞数目与年龄无关（r=0．098，P=0．817），而细胞的成脂分化能力与年龄呈明显负相关（r=-0．568，P〈0．01。②成脂诱导后脂肪干细胞形态变化及油红O染色定性结果。脂肪干细胞经诱导后体积增大，分化为成脂细胞，细胞浆中可见许多大小不等的橙红色脂滴，多者可占整个细胞体积的80％-90％，细胞核缩小或偏于细胞的一侧，呈阳性；而在普通培养基中生长的对照细胞未见体积增大和脂滴形成，呈阴性。 结论：患者年龄越大，成脂分化率越低，且同一患者不同部位来源的脂肪抽吸组织中的脂肪干细胞在成脂诱导分化能力上存在差异。提示利用脂肪干细胞进行相关实验时，在患者年龄和取材部位上应有所选择，进一步分析有可能找到获取脂肪干细胞的最佳部位。     

维拉帕米及尼卡地平对瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响

目的:研究钙离子拮抗剂维拉帕米及尼卡地平对体外培养的瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响,同时对两种药物疗效进行比较,讨论两种药物的作用特点.方法:向对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞及瘢痕疙瘩成纤维细胞中加入不同浓度的两种药液,培养48小时后进行羟脯氨酸比色试验,并将OD值依公式换算成羟脯氨酸含量,进行统计学比较.结果:维拉帕米及尼卡地平组随着用药浓度的提高,细胞形态变化越来越明显,两种成纤维细胞显示出类似的形态学特点;与对照组比较,两药均可以降低培养上清液中羟脯氨酸的含量,且随用药浓度增加,羟脯氨酸含量进一步下降,高(100μmol/L)低(10μmol/L)浓度组均有显著性差异(p<0.05),同时两药作用特点也有所不同.结论:维拉帕米和尼卡地平均可降低增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的胶原含量,抑制胶原合成,对于增生性瘢痕,尼卡地平抑制作用略强于维拉帕米,而对于瘢痕疙瘩,则维拉帕米的抑制作用略强于尼卡地平.     

维拉帕米及尼卡地平对瘢痕组织抑制作用的体外实验

目的研究钙离子拮抗剂维拉帕米及尼卡地平对体外培养的瘢痕组织的成纤维细胞增殖的抑制作用,同时对两药药效进行比较,观测两药的作用特点。方法四甲基偶氮唑（MTT）比色法检测两药对瘢痕组织的成纤维细胞增殖的影响：向对数生长期的患者病理性瘢痕组织的成纤维细胞中分别加入不同浓度维拉帕米及尼卡地平（150、100、50、10、0μmol／L）,分别在用药后24、72、120h进行MTT法检测,将吸光度值（A值）换算为生长抑制率,根据直线回归法计算出各时间点的半数有效抑制浓度（IC50）并进行统计学比较。结果维拉帕米及尼卡地平均显示很强的对瘢痕组织成纤维细胞增殖的抑制作用。但作用特点各有不同,维拉帕米在早期作用强于尼卡地平（P〈0．05）。而随时间延长,在3～5d时反而减弱,而尼卡地平则显示出较好的时间依赖性,在5d时其抑制作用明显强于维拉帕米（P〈0．05）。结论维拉帕米及尼卡地平对瘢痕组织成纤维细胞增殖抑制作用的时效不同,为两药联合应用治疗瘢痕提供了理论依据。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞的基因组学研究

目的 寻找瘢痕疙瘩致病相关基因，探讨瘢痕疙瘩的发生机理。方法 利用含1100个人类肿瘤相关基因的cDNA芯片(cDNA—microarray)对耳垂和胸部瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞进行检测，初步分析瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因总体表达的差异，并筛选出差异基因。结果 在耳垂及胸部瘢痕疙瘩成纤维细胞中，分别有8种和17种特异性表达基因被检出。在正常皮肤中特异性表达的细胞增殖抑制基因Mda-7，在耳垂及胸部瘢痕疙瘩成纤维细胞中均未被表达。结论 多种基因参与了瘢痕疙瘩的形成过程，瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞之间存在基因表达的差异，增殖因子受体PAR-1和增殖抑制基因Mda-7可能参与瘢痕疙瘩的形成。     

人脂肪干细胞在体外向成脂和成软骨细胞诱导分化的实验研究

目的了解从人体抽吸的脂肪组织中获得的脂肪干细胞在体外向成脂和成软骨细胞诱导分化的情况。方法临床提取8例人脂肪抽吸组织中的间充质干细胞,在体外分别进行成脂和成软骨诱导分化,并通过油红O染色、阿尔辛蓝染色和免疫组化的方法进行证实。结果脂肪干细胞经成脂诱导后,向成脂细胞分化,细胞内出现油红O染色阳性脂滴;经成软骨诱导后,细胞向成软骨细胞分化,分泌软骨特异性基质成分硫酸蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。结论在适当的诱导条件下,来源于人体多部位脂肪抽吸组织中的干细胞具有向成脂和成软骨细胞分化的能力,本实验为进一步应用人体脂肪干细胞进行脂肪和软骨组织工程研究打下实验基础。     

双氢青蒿素治疗急性弓形虫感染小鼠疗效的进一步观察

本实验对双氢青蒿素治疗小鼠急性弓形虫感染的疗效进行了进一步考察。小鼠腹腔内感染 RH株弓形虫速殖子 2× 1 0 3,8h后给予单独双氢青蒿素 75mg/kg· d和双氢青蒿素 75mg/kg· d联合磺胺嘧啶钠1 0 0 mg/kg· d灌喂小鼠治疗 ,每日 2次 ,疗程 1 5天 ,观察小鼠存活率 ,并于感染后第 9、 1 5、 3 1天取小鼠腹水及肝脏进行虫体 PCR检测。双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠组小鼠存活率达 93 % ,与单独磺胺嘧啶钠 ( 2 0 0mg/kg·d)组存活率 ( 69.3 % )及单独双氢青蒿素 ( 75mg/kg·d)组存活率 ( 0 % )都有显著性差异 ( P<0 .0 5,P<0 .0 1 )。 PCR检测可见小鼠腹水或腹腔冲洗液中除联合治疗组外 ,其余各组均可检测出虫体DNA,但只有对照组和单独双氢青蒿素组小鼠的肝脏中可检测出虫体 DNA。结论 ( 1 )双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠以上述方式治疗小鼠急性弓形虫感染产生了协同作用 ,比两药单独治疗对小鼠的保护作用更好 ,能更快地清除腹腔中的弓形虫 ,并更有效地防止停药后的复发。( 2 )单独双氢青蒿素采用以上方案疗效不理想 ,只能延长小鼠存活时间。( 3 )以上各种治疗方案除单独双氢青蒿素组外 ,都可较好地清除小鼠肝脏中的虫体。( 4)本研究为双氢青蒿素临床治疗急性弓形虫感染提供了更具体、合理、有效的用药方案     

细胞培养技术教学模式的探索与思考

细胞生物学是一门实验性很强的学科,是理论知识和实践操作密切相关的学科。大部分医学研究生在研究生阶段要掌握细胞生物学理论知识,并进行一系列细胞生物学课题研究。因此掌握最基本的细胞培养技术就显得尤为重要。作为细胞培养室的技术指导老师,在几年教学中,我不断优化和总结教学内容和教学模式,目的是培养学生实事求是的科学态度,使学生尽快养成良好的实验习惯、掌握细胞培养的基本技能。     

敲减PTGS2对皮肤成纤维细胞基因表达谱的作用

 目的 运用RNAi干扰正常皮肤成纤维细胞前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)基因的表达,应用基因芯片技术研究其对成纤维细胞全基因组表达谱的影响,在基因水平上探索防治瘢痕疙瘩的新途径。方法 对成纤维细胞PTGS2基因进行siRNA干扰,利用RealTime RT-PCR验证siRNA沉默效果;应用全基因组芯片检测基因表达谱变化。结果 成纤维细胞的PTGS2基因经siRNA干扰后,其mRNA表达水平明显下调;全基因组芯片表达谱检测到的差异表达基因,按1.5倍差异共189个（115个上调,74个下调）,按2倍差异共14个（9个上调,5个下调）;基因表达谱的变化与瘢痕疙瘩基因表达谱的变化相吻合,可能促使正常皮肤成纤维细胞向瘢痕疙瘩方向进展。结论 检测到与PTGS2基因相关的、在瘢痕疙瘩形成中可能共同发挥作用的相关基因,证明PTGS2与瘢痕疙瘩的发病机制有着密切的关系,为治疗瘢痕疙瘩提供了一个潜在的候选靶点。     

骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的调节作用研究

目的：研究探讨小鼠骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的节作用影响情况。方法：通过流式细胞术研究对比衰老小鼠和年轻小鼠T细胞培养48h后CD8＋CD28＋的共表达率差异,根据以上研究结果分别对比隔离共培养组、混合共培养组和对照组之间T细胞上CD8＋CD28＋的共表达率差异。结果：实验一中衰老组培养48h后CD8＋CD28＋共表达率为（4.08±0.3493）%,年轻组培养48h后CD8＋CD28＋共表达率为（5.04±0.5741）%。两者相比有统计学差异（P〈0.05）。实验二隔离共培养组中骨髓间充质干细胞与淋巴细胞以1：1在Transwell系统中共培养,48h后其对应的CD8＋CD28＋共表达率为（10.26±1.0784）%,混合共培养组中骨髓间充质干细胞与淋巴细胞以1：1比例在六孔板中共培养,48h后CD8＋CD28＋共表达率为（6.42±1.5680）%。对照组中淋巴细胞以106数量进行培养,48h后CD8＋CD28＋共表达率为（4.08±0.3493）%。两两对比有统计学差异（P〈0.05）。结论：衰老小鼠和年轻小鼠的T细胞在CD8＋CD28＋的共表达比例上存在差异。骨髓间充质干细胞能够通过分泌的某些细胞因子使这种衰老的T细胞变得趋向于＂年轻态＂。