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1.
目的:克隆MAGE-1基因并对其进行原核表达及鉴定。方法:通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从原发性肝癌的细胞中扩增MAGE-1基因片段,将该片段克隆在原核表达载体PET-32a中,重组克隆转化大肠杆菌BL21(DE3),表达的蛋白以His亲和柱层析纯化,并用Dot-blot和Western-blot对其进行鉴定。结果:经RT-PCR扩增出930bp基因片段,经测序分析后的DNA序列与Genbank中的报道序列同源程度达98%,构建含重组表达载体PET32-M1的工程菌,经IPTG诱导表达、纯化,MAGE-1蛋白浓度为0.48mg/ml,经Dot-blot和Western-blot检测,纯化蛋白可以与商业化的驴抗MAGE-1的多抗结合。结论:成功扩增了肝细胞肝癌中的MAGE-1基因全长cDNA并对其进行了原核表达与鉴定,为进一步研究MAGE-1基因的功能和研制有临床价值的全人抗MAGE-1抗体奠定了基础。  相似文献
2.
目的:应用抑制差减杂交技术(supression subtractive hybridization,SSH)结合cDNA芯片筛选人肝细胞癌中差异表达基因.进一步探讨所筛选出的钙磷脂结合蛋白(annexinⅡ)在肝细胞中的表达及作用.方法:以肝癌组织和非肿瘤肝组织进行SSH,构建正、反向差减杂交文库,差减片断的PCR产物制备cDNA芯片,筛选出肝癌组织中差异表达基因.进一步应用荧光实时定量技术验证芯片结果,免疫组化方法分析annexinⅡ在肝细胞癌和正常肝组织中的表达.结果:成功构建了肝细胞癌差减杂交文库.芯片结果显示annexinⅡ在肝细胞癌中高表达并经荧光实时定量技术证实.免疫组化结果表明annexinⅡ在肝细胞癌和癌旁肝硬化组织中高表达,在正常肝组织中不表达(P<0.05).在低分化肝细胞癌中annexinⅡ的表达有增高趋势.结论:SSH方法构建的肝细胞癌差减杂交文库富含肝细胞癌差异表达基因.肝细胞癌中高表达基因annexin Ⅱ可能与肝细胞的恶性转化,肝癌细胞的转移和侵袭能力有关.  相似文献
3.
目的:应用噬菌体展示技术制备抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latert membrare protern 1,LMP1)特异性?高亲和力的全人抗体Fab片段?方法:利用稳定转染表达LMP1的SUNE-1细胞及原核表达的LMP1胞外区蛋白作为抗原对大容量人源Fab抗体库进行差减筛选及固相筛选,经过5轮细胞筛选和3轮固相筛选,随机挑选30个克隆经酶联免疫吸附法鉴定,阳性克隆进行可溶性表达,用LMP1阳性表达的人鼻咽癌细胞株HNE2/LMP1鉴定抗LMP1抗体Fab的结合活性?结果:Western blot?免疫荧光结果显示,从大容量人源Fab抗体库中筛选出1株抗LMP1抗体Fab,细胞ELISA?荧光激活细胞分类术?免疫荧光分析?免疫组化检测结果显示Fab与人鼻咽癌细胞表面LMP1分子有较好的结合活性?结论:从人源Fab抗体库中筛选的Fab抗体能够与鼻咽癌细胞表面LMP1分子特异性结合,为研制用于EBV相关肿瘤如鼻咽癌生物治疗的靶向药物,提供了候选分子?  相似文献
4.
目的:探讨miR-335上游片段是否具有转录活性以及罗格列酮和胰岛素对miR-335启动子区域转录活性的影响。方法:利用PCR技术克隆位于MEST内含子中miR-335上游区域的不同片段,采用双荧光素酶报告基因系统鉴定其转录活性。使用1μmol/L的罗格列酮及不同浓度的胰岛素进行干预并观察转录活性有无变化。结果:不同的miR-335启动子区域转录活性不同,在miR-335上游约600个碱基区域活性最高。未使用药物干预组细胞中,miR-335启动子区域活性的表达与基础值相比差异无统计学意义(P>0.05);使用1μmol/L罗格列酮干预后,miR-335启动子区域活性显著升高(P<0.01),使用10~12 mol/L的胰岛素干预时,启动子活性升高,但当胰岛素浓度上升后,启动子活性变化并没有统计学差异。结论:miR-335上游约600个碱基为启动子关键区域,同时,miR-335有可能通过自身的转录调控机制参与肥胖与胰岛素抵抗的发生发展。  相似文献
5.
目的 研究白虎二地汤对实验性2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗大鼠炎症信号通路的影响,并探讨其机制。方法 采用高糖高脂饲料喂养联合低剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立T2DM胰岛素抵抗大鼠模型,将大鼠分为正常对照组、模型组、罗格列酮组、白虎二地汤高、低剂量组。连续给药6周后,观察其空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的变化,采用Western blot法检测大鼠骨骼肌组织IRS-1、p-IRS-1和PI3Kp85蛋白的表达。结果 白虎二地汤高剂量组可明显降低2型糖尿病大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、TNF-α、IL-6(P<0.05),使骨骼肌组织IRS-1和p-IRS-1蛋白表达量降低,PI3Kp85蛋白的表达量升高。结论 白虎二地汤可以改善STZ诱导的T2DM胰岛素抵抗大鼠炎症反应,减轻胰岛素抵抗。其可能的机制是通过炎症信号通路,减轻炎症反应,提高肌肉组织PI3K蛋白的表达,从而减弱外周胰岛素抵抗。  相似文献
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