抗严重发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白单链抗体的筛选和鉴定

目的筛选及表达抗严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)包膜糖蛋白(Gn)单链抗体(scFv)。方法利用人源化SFTSV的scFv文库与固相化包被的SFTSV-Gn蛋白特异性结合,经过4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选能特异性结合SFTSV-Gn蛋白的噬菌体scFv,随机挑取最后一轮单菌落进行噬菌体-ELISA鉴定,将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中原核表达,用Western blot法鉴定scFv的表达, ELISA鉴定纯化后scFv的结合活性。结果筛选出3株不同序列的抗SFTSV-Gn蛋白的scFv, Western blot法结果显示scFv得到正确表达, ELISA结果显示纯化后的scFv具有结合活性。结论成功筛选及表达了抗SFTSV-Gn蛋白的scFv。     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

肠道病毒71型感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的miRNA表达谱

目的 研究肠道病毒71型(EV71)感染神经细胞的miRNA表达谱,探讨miRNA在病毒感染神经细胞中的可能作用.方法 建立EV71感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)模型,收集感染后48 h细胞.以Taqman低密度芯片检测miRNA表达谱,使用实时RT-PCR对芯片结果进行验证并在TargetScan和miRanda网站预测靶基因,采用GO和KEGG分析靶基因功能.结果 成功建立EV71感染SH-SY5Y细胞模型,通过低密度芯片筛选出215种显著升高的miRNA和25种显著下调的miRNA.经过RT-PCR验证,3种miRNA(MiR-10a*、miR-15b*和miR-195)显著下调,7种miRNA(miR-10a、miR-342-5p、miR-483-5p、Let-7b、miR-99a、miR-140-5p和miR-21)显著上调,与芯片结果相符.GO分析显示发展进程和信号调节条目最富集靶基因.KEGG路径分析显示靶基因在肿瘤路径、蛋白水解、Wnt信号传导、黑素形成、粘附连接、MAPK信号通道最富集.结论 EV71感染神经细胞48 h后miRNA表达谱发生改变,10种变化的miRNA靶基因预测在发展进程、信号传导及凋亡中起着重要的作用,可为后期机制研究提供参考.     

大肠杆菌O157∶H7 CVa9株O抗原变异的研究

目的　研究本实验室保藏的大肠杆菌O15 7:H7(E coliO15 7:H7)日本分离株CVa9O抗原的变异。方法　血清凝集试验检测CVa9菌株O和H抗原 ,区分O抗原变异株与非变异株。聚合酶链反应 (PCR)法分别检测O15 7和H7特异性基因。生化试验检测生化特性。观察菌株在麦康凯、山梨醇麦康凯、棉子糖麦康凯及ChromagarO15 7显色培养基上菌落形态 ,菌落计数法计算变异率。结果　抗 -O15 7抗血清与CVa9菌株进行玻片凝集试验出现强凝集 (CVa9- 8)和不凝集 (CVa9- 1、CVa9- 15 )两种菌落 ,试管凝集试验结果相同 ,证实不凝集菌落O抗原发生变异。抗 -HT 抗血清分别与变异株和非变异株H抗原进行试管凝集试验 ,均为强凝集。两种菌株O15 7和H7特异性基因均为阳性。变异株与非变异株生化特性基本相同 ,但变异株不发酵棉子糖。两种菌株在麦康凯及山梨醇麦康凯培养基上菌落形态特征没有区别。在ChromagarO15 7显色培养基上培养 4 8h ,变异株为浅紫红色 ,菌落周边呈毛边状 ,非变异株为紫红色 ,菌落边缘整齐。变异株在用棉子糖代替乳糖制备的棉子糖麦康凯培养基上菌落呈粉红色 ,非变异株呈红色。菌落计数显示变异率为 99 80 %。结论　CVa9菌株在保存过程中O抗原发生变异 ,菌落形态及部分生化特征亦有所改变。变异株和非变异株均携带O15     

中西医结合治疗脑梗死60例疗效观察

目的:观察中西医结合治疗脑梗死的疗效。方法:100例患者随机分为两组。对照组静滴低分子右旋糖酐500 ml、银杏达莫20 ml,同时口服阿司匹林0.75 g,每晚1次;治疗组在对照组用药基础上,加服中药通脉汤加减,日1剂。结果:两组有效率分别为93.33%与85%,治疗组优于对照组(P<0.01)。结论:中西医结合治疗脑梗死安全、效佳,值得推广。     

一种基于NASBA技术的新型快速肠道病毒检测方法的应用研究

目的: 基于核酸等温扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)荧光分子信标探针检测技术,进行肠道病毒的快速检测与辅助诊断?方法:根据Genebank上肠道病毒5′端非编码区序列,设计特异性引物与捕获探针,应用纳米技术对商品化磁珠进行偶联,NASBA方法进行扩增,NucliSens读数仪检测,荧光定量RT-PCR方法进行验证,同时验证NASBA方法的特异性?灵敏度和重复性?结果:该方法对肠道病毒具有高度特异性,与RSV等呼吸道相关病毒均无交叉反应,反应体系具有很高的稳定性?结论:本研究应用的肠道病毒NASBA检测方法特异?灵敏?快速简便,适用于肠道病毒的日常监测和爆发疫情的应急诊断?     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒血清流行病学调查

目的 调查江苏省人与动物发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)血清流行病学情况,为控制疫情提供流行病学线索。 方法 2010年7-11月在江苏省南京江宁区、溧水县,常州溧阳市,无锡宜兴市,淮安盱眙县和连云港东海县共采集2853份血清,其中人血清1922份、动物(犬、羊、猪、牛、鹅、鼠和鸡)血清931份, 运用双抗原夹心ELISA法检测血清中SFTSV总抗体,并进行不同地区SFTSV总抗体阳性率比较。 结果 本次调查2853份血清样本中SFTSV总抗体阳性血清121份,阳性率为4.24%,提示江苏省存在SFTSV的流行。在7种被调查的动物样本中,5种动物(犬、羊、牛、猪、鸡)血清样本SFTSV总抗体阳性,阳性率分别为6.40%、57.14%、31.82%、5.33%和0.98%;人血清中SFTSV总抗体阳性率为0.94%。血清中SFTSV总抗体阳性率存在地区差异。人群与动物SFTSV血清总抗体阳性率存在正相关关系。 结论 江苏省是SFTSV的流行区域,需加强SFTSV的预防意识及诊断能力。     

大肠埃希菌O157∶H7特异基因检测与毒力基因分析

目的 :对江苏省 2 0 0 0和 2 0 0 1年分离的经血清玻片凝集试验初筛为大肠埃希菌O15 7∶H7(E .coliO15 7∶H7)的菌株进行O15 7O抗原及H 7抗原特异性基因检测 ,了解 2 0 0 0年监测点宿主动物分离O15 7菌株毒力基因携带率及毒力基因图谱。方法 :用聚合酶链反应法检测O15 7特异基因、H 7特异基因 ,多重引物聚合酶链反应法检测VT1、VT2、eaeA、hly等毒力基因并进行分析。结果 :13 4株血清玻片凝集试验初筛为E .coliO15 7∶H7的菌株经特异基因检测确定为E .coliO15 7的占 72 .4% (97 13 4) ,E .coliO15 7∶H 7的仅为 2 9.1% (3 9 13 4) ;非O15 7菌株占 2 6.9% (3 6 13 4) ,有44 .3 % (5 8 13 4)的O15 7菌株鞭毛抗原不是H7。 2 0 0 0年宿主动物分离菌株 ,经特异基因检测为非O15 7的不携带毒力基因 (0 18) ;为E .coliO15 7∶H ?的菌株 ,毒力基因携带率为 10 .7% (3 2 8) ;确定为E .coliO15 7∶H 7的菌株 ,毒力基因携带率高达 93 .1% (2 7 2 9) ,且毒力基因型以VT2 eaeA hly为主。 结论 :特异性基因检测鉴定E .coliO15 7∶H7,可大大减少血清玻片凝集试验的误判 ,结合毒力基因检测 ,可分析E .coliO15 7∶H 7菌株毒力基因型的变化 ,对制定切实有效的防制对策控制E .coliO15 7∶H7流行具有重要意义     

EHEC O157:H7志贺毒素Ⅱ型A、B亚单位的表达及功能鉴定

目的 克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shiga toxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能.方法 从EHECO157:H7基因组中克隆编码Stx Ⅱ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切后,导入表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌Topl0F',经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-A和GST-B融合蛋白.分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得高免血清,观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 Stx Ⅱ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化;A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击.结论 Stx Ⅱ型A、B亚单位蛋白可以作为EHEC O157:H7疫苗的候选分子,同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用.