体外培养小鼠睾丸间质细胞的形态学特征

本研究初步观察了睾丸间质细胞体外培养的形态学特征,以期为深入研究其分泌睾酮的影响因素奠定基础.方法为无菌取成年雄性昆明小白鼠的双侧睾丸,置于盛有适量PBS的培养皿中;用尖镊撕去附睾及白膜,用吸管吹打至曲细精管与间质组织分散;加入10倍体积的胶原酶,37℃下消化10～15 min后移入10 mL离心管,待曲细精管及间质组织沉降后移出上层细胞悬液;取一滴细胞悬液,加入适量台盼蓝混匀后用红细胞记数板计算细胞数目,调整细胞密度至3×105个/mL;将细胞接种在直径35 mm的塑料培养皿中,常规条件下培养;当细胞开始贴壁时,小心吸去旧液,加入新鲜培养液(D-MEM+10%小牛血清+1%双抗+1%谷氨酰胺)培养,定时观察;当培养细胞80%汇合时,弃去培养液,用PBS缓冲4%多聚甲醛室温固定1 h,PBS洗2次;用异丙醇油红法略加改进后进行脂质染色,苏木精复染;另用95%乙醇和PBS缓冲4%多聚甲醛(9∶1)室温下固定细胞40 min,PBS洗2次,1.4%甲基蓝染色后进行观察.本实验每次所获细胞悬液量均为3 mL,细胞密度为1.76×106个/mL,平均每侧睾丸可获间质细胞5.28×106个,其中活细胞、死细胞的平均百分比分别为88.94%、12.06%.在体外,间质细胞贴壁性状良好,不需特殊粘附分子.接种后一般8～10 h后即发生极化,胞质铺展,伸出突起.培养约14～15 h后即开始贴壁.镜见贴壁细胞透明,基本无颗粒,轮廊不清,增殖的细胞相互连接成单层膜状.细胞化学:甲基蓝染色显示,间质细胞核呈圆形或卵圆形,嗜碱性,位于胞质中央;核仁1～2个,清晰可见,一般位于核的边缘部;其胞质轮廊为多角形,一般有3～4个突起,遥抟中可见有多量大小不一的空泡状结构.油红O脂质染色显示,这些空泡状结构为脂质小滴,呈红色或红褐色,大小不一,圆形悬浮状存在,聚集于胞质两极或散布于核的四周.本实验结果表明,间质细胞胞质中存在大量脂滴,推测这些脂质是为其雄激素分泌功能提供必备前体物质而存在的.     

版纳微型猪近交系AQP3克隆、序列分析及组织表达

目的 克隆版纳微型猪近交系aquaporin 3(AQP3)基因,并利用生物信息学方法分析其序列特征,研究其在猪各组织中的表达情况.方法 从版纳微型猪近交系脾脏中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增猪AQP3编码区序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH 5α,筛选阳性克隆进行测序.并采用半定量RT-PCR方法分析版纳微型猪近交系不同组织中AQP3基因的表达情况.结果 成功克隆出AQP3基因编码区全长873 bp的序列,GenBank登录号为HQ888860,其编码290个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,与牛的AQP3基因同源性最大,达99％.多组织半定量RT-PCR研究表明AQP3 mRNA在BMI猪的脾脏、肾脏、肺、小肠中均有表达,其中脾脏中表达最高.结论 成功克隆出了版纳微型猪近交系AQP3基因全长编码区,并对其编码的蛋白质功能进行了预测,为进一步的功能研究奠定了基础.     

人类睾丸生精细胞体外培养的初步研究

目的对人类生精细胞体外培养分化、成熟进行初步研究。方法将4例患者的睾丸组织制备成生精细胞，观察生精细胞体外培养后生精细胞的分化、成熟情况。结果4例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化、成熟。初级精母细胞能分化为精子细胞，分化率平均为0．47％～1．50％；Sa期精子细胞能变形、成熟为Sc期精子细胞，成熟率为0．93％～5．72％。结论在该研究条件下，人类睾丸生精细胞体外培养能进一步分化、成熟。     

BrdU标记在大鼠生精细胞体外培养中的应用

目的探讨应用5-溴-2-脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxy-uridine，Brdu）标记检测大鼠生精细胞体外的分化、发育情况。方法采用BtdU体内标记生精细胞的DNA，免疫细胞化学法跟踪观察大鼠生精细胞在体外培养中的分化、发育情况。结果培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞。经培养后在BrdU标记的细胞中出现早期精子细胞。结论大鼠生精细胞体外培养过程中，应用BrdU标记能检测生精细胞的分化、发育情况。     

哺乳动物初级精母细胞体外培养的研究

目的:探讨哺乳动物初级精母细胞体外培养分化的可能性.方法:制备雄性大鼠睾丸初级精母细胞,与非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)共培养,观察初级精母细胞体外培养过程中的生长行为,用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记跟踪观察大鼠初级精母细胞在体外培养中的分化情况.结果:大鼠初级精母细胞与Vero细胞共培养后能进行减数分裂阶段分化,生成精子细胞;BrdU标记检测结果显示,培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞,培养后在有BrdU标记的细胞中有早期精子细胞.结论:哺乳动物初级精母细胞在体外培养中能进行分化.     

小牛血清及维生素对小鼠生精上皮细胞冻存的影响

目的 :探讨维生素C(VC)、维生素E(VE)及小牛血清 (NBS)对冻存小鼠生精上皮细胞的影响。　方法 :在DMEM培养液 10 %二甲基亚砜 (DMSO)的基础上 ,分别添加 0～ 2 0 %NBS ,以及在DMEM培养液 10 %DMSO 10 %NBS的基础上 ,分别添加 15 0 μg/mlVC及 5 0 μg/mlVE,冷冻保存 7d龄小鼠生精上皮细胞 ,37℃水浴复苏 ,锥虫蓝染色检查细胞复苏率。　结果 :冻存液中分别含 0、5 %、10 %及 2 0 %NBS时 ,细胞复苏率分别为 83.4 %、84 .7%、85 .7%及 83.6 % ,各复苏率之间差异无显著性 (P >0 .0 5 )。冻存液中分别含 15 0 μg/mlVC及 5 0 μg/mlVE时 ,细胞复苏率分别为 88.0 %及 82 .9% ,其复苏率与未加维生素的冻存液组 (85 .7% )相比差异无显著性 (P >0 .0 5 )。　结论 :在冻存液中添加不同浓度的NBS及添加抗氧化剂VC或VE,对小鼠生精上皮单细胞冻存没有明显的保护作用 ,不能显著提高细胞复苏率     

大鼠生精细胞分离方法的研究

目的:建立一种简单、有效的哺乳动物睾丸生精细胞分离方法。方法:采用研磨-Percoll法、单一酶-研磨-Percoll法、组合酶法制备成熟期前大鼠睾丸生精细胞,分析比较其细胞总数、分离所需时间和细胞纯度,以及检测细胞培养前后的存活率。结果:组合酶法得到的睾丸生精细胞总数最多、分离所需时间最短;获得的细胞含杂质最少、细胞存活率最高;细胞培养48h后的存活率高,与其他两种分离方法比较有显著性差异(P<0.05)。结论:用组合酶法能在较短时间内获得数量较多的、比较纯化和存活率较高的生精细胞。     

云南白纹伊蚊盖塔病毒的分离鉴定

目的:对我国云南省边境线获得的未知病毒进行分离鉴定。方法:将样本进行随机聚合酶链式反应,纯化链接到载体中进行序列的测定,确定病毒为甲病毒属类盖他病毒,然后用特异性引物进行衣壳蛋白基因和3’UTR区序列进行DNA测序,分析比较该病毒的分子生物学遗传特征,绘制系统发育树。结果:该病毒为盖塔病毒。结论:该病毒与韩国分离株和河北两株亲缘关系较近,而与MM2021马来西亚原始毒株亲缘关系较远。     

哺乳动物雄性生殖系及其来源的干细胞系

哺乳动物两性配子(精子和卵子)相互结合形成双倍体合子(也称受精卵),启动新一代个体的整个发育过程,不仅形成子代成体中所有组织的干细胞,而且还形成子代生殖细胞的干细胞。在这个意义上,生殖细胞是物种的“干细胞”,是哺乳动物连接亲代与子代的唯一桥梁,它们将遗传信息一代代传递下去,对于种族延续是必需的,又是独一无二的。生殖系中的双倍体细胞在形成单倍体配子的过程中,将发生遗传重组:①同源染色体联会;②同源染色体随机分配。遗传重组产生遗传变异,创造了遗传多样性,从而为物种的自然选择或人为选择提供了丰富的素材。因而,生殖系对于…