小鼠隐睾模型研究进展

隐睾症是指睾丸下降异常,使睾丸不能降至阴囊而停留在腹膜后、腹股沟管或阴囊入口处.隐睾的发病率为1.6% ～ 9.0%,先天隐睾患儿发病率则为0.9% ～ 1.8%,近年来的研究发现隐睾的患病率呈增高的趋势[1].     

改良消化富集法提高精原干细胞富集效率的实验研究

目的 建立一种改良的小鼠精原干细胞消化富集方法,为精原干细胞体外长期培养和移植奠定基础.方法 收集120个出生4～d BALB/c新生小鼠的睾丸,平均分为对照组和实验组,分别采用传统的两步消化法(对照组)和改良消化法(实验组)分离消化获得细胞悬液,并种植到铺有明胶的培养皿中,于种植后1h、5h、24h通过差速贴壁法去除体细胞,获得富集的精原干细胞.以Thy-1作为精原干细胞的表面标志,分别在3次差速贴壁前、后采用流式细胞仪检测Thy-1阳性细胞的比例,比较两组精原干细胞的富集效率.结果 实验组和对照组消化所获得的细胞数分别为(3.4±0.5)×105/睾丸和(3.6±0.3)×105/睾丸,无统计学差异(P＞0.05).然而,实验组细胞贴壁具有良好的活性,初次贴壁仅需40～50min,而对照组细胞需要4～5h甚至过夜培养才能贴壁.3次差速贴壁后,实验组Thy-1阳性细胞占睾丸细胞的比例为(56.3±4.7)%,而对照组仅为(32.6±4.2)%,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 改良消化富集法能明显提高睾丸细胞活性和富集效率,可获得大量高度纯化的精原干细胞,为精原干细胞培养和移植奠定基础.     

保留前列腺尖部包膜的膀胱全切与原位回肠新膀胱术

目的探讨膀胱癌根治性全切术中保留前列腺尖部包膜与原位回肠新膀胱术的临床疗效。方法对34例膀胱癌患者行保留前列腺尖部包膜的膀胱全切与原位回肠新膀胱术。术中保留距前列腺尖部约1cm的前列腺包膜及血管神经束。术后对患者进行定期随访，了解患者术后控尿、性功能及瘤控效果。结果所有患者均顺利完成保留前列腺尖部包膜和勃起血管神经束的膀胱根治性切除与原位回肠新膀胱术。手术时间为240～370min，平均273min；术中出血200800ml，平均385ml。术后随访3～36个月，所有患者均可自主排尿，新膀胱容量250-350ml，残余尿量0～80ml，除1例患者白天控尿良好，夜间少量漏尿外，其余患者均控尿良好。术前阴茎勃起正常23例患者中，术后6个月有10例（43．4％）阴茎勃起正常。术后所有患者均未出现局部及尿道残端复发的现象。术后9个月1例出现肺部转移。结论保留前列腺尖部包膜的术式是以改善尿控为主要目的，在不降低瘤控效果的前提下的一种改良术式。     

以α6-integrin和c-kit为特异性表面标志分离筛选小鼠精原干细胞的可行性

背景:从目前文献报道来看,精原干细胞分离效率较高且较为公认的方法是通过隐睾模型结合表面标志进行多参数筛选.目的:探讨06-integrin和c-kil作为分离筛选精原干细胞特异性表面标志的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-05/12在武汉大学人民医院完成.材料:6周龄雄性昆明白小鼠40只,随机分为隐睾组、正常对照组,20只/组.方法:隐睾组小鼠建立隐睾模型,麻醉后腹部正中切口,将两侧睾丸拉入腹腔,将脂肪垫靠近附睾处各缝一针,分别固定在侧腹壁.正常对照组小鼠不进行任何干预.造模后两三个月,采用传统的两步消化法获取生精上皮单细胞悬液,加入FITC标记的抗α6-integrin抗体和PE标记的抗c-kit抗体,利用流式细胞仪进行α6-integrin+和c-kit双重筛选,锥虫蓝染色监测细胞活性.主要观察指标:隐睾的形态学变化,精原干细胞分选结果.结果:隐睾小鼠的生精小管内细胞排列紊乱,层次及管腔消失,小管中央可见分裂相细胞,细胞数明显减少.与正常对照组比较,隐睾组side scatter(low)、Forward scatter(hi)区的睾丸细胞增多,图形向左上移位.α6-integrin+和c-kit-细胞分布存在明显的相互偏离,即α6-integrin+细胞绝大多数不是精原干细胞,c-kit-细胞绝大多数也不是精原干细胞.从隐睾组筛选出具有sidescatter(low)、α6-integrin+、c-kit-特征的细胞数占睾丸细胞总数的2.8%,此即为精原干细胞,锥虫蓝监测结果显示细胞活性达95%以上.结论:采用α6-integrin和c-kit这两种表面标志进行精原干细胞的筛选,尽管可以提高细胞悬液中的精原干细胞纯度,但均缺乏特异性.     

精原细胞的增殖和分化

精原干细胞As是体内唯一既能自增殖又能分化的细胞，其自增殖与分化的比率由支持细胞(sertoli cells)分泌的胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotorphic factor GDNF)调控。在生精周期的第8阶段，几乎所有的Aal、少量的Apr和极少量的As型精原细胞均分化成A1型精原细胞，许多因子如SCF／c-kit系统、DazlRNA结合蛋白、周期素D2和视黄酸在此分化阶段起调节作用。生精小管中有均匀的精母细胞分布，是由A2、A3、A4型精原细胞的选择性凋亡得以实现的，Bcl-2家族成员Bax和Bcl-xl对精母细胞的均匀分布起重要作用。     

犬自体睾丸移植术式的改进

目的建立犬自体睾丸移植术的改进方法。方法健康成年雄性杂种犬30只,年龄1.5~2.0岁,体重14~17kg。切取带腹主动脉瓣和下腔静脉瓣的睾丸动、静脉,并进行灌注及冷保存。将睾丸动、静脉分别与同侧髂外动、静脉进行端侧吻合,行自体睾丸移植术30只。对睾丸灌注、带瓣睾丸血管的切取及血管吻合等关键步骤进行了改进。观察术后犬生存情况,对移植的睾丸进行影像学及组织学检查,测定犬术后不同时间点的性激素水平。结果自体睾丸移植30只,成功27只,成功率90%。其中睾丸热缺血4.5±0.9min,冷缺血50.0±10.0min,睾丸血管吻合35.5±5.5min,总手术时间3.5±0.5h。数字减影动脉造影(digitalsubtractionarteriography,DSA)证实成活睾丸血供良好;组织学检查显示精曲小管的各期生精细胞形态无异常,层次及数量无减少,管腔内有少量精子;术后各时间点,黄体生成素较术前明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),睾酮及卵泡刺激素与术前差异均无统计学意义(P>0.05)。结论建立了改进后稳定而可行的犬自体睾丸移植的手术方法,为研究人睾丸移植提供了可靠的依据。     

耻骨前入路阴茎肉膜固定术治疗小儿埋藏式阴茎

目的:观察耻骨前入路阴茎肉膜固定术治疗小儿埋藏式阴茎的效果。方法:2002年8月~2003年12月共采用该术式治疗小儿埋藏式阴茎34例,并进行随访,观察术后效果及复发情况。结果:平均手术时间为45m in,34例患儿术后均获满意疗效。获1年以上随访21例,失访13例。随访病例中未见复发。结论:该术式设计合理、简单、有效,适合于无包皮不足的小儿埋藏式阴茎。     

小鼠隐睾模型制作方法的改进

目的:简化隐睾模型的制作方法,提高隐睾模型的质量。方法:60只68周龄昆明白小鼠随机分为实验组、模型对照组、正常对照组,每组20只。实验组,速眠新麻醉,常规消毒阴囊,将睾丸挤入腹腔,于阴囊根部连续性缝合结扎阴囊。模型对照组用经典的方法,切开腹壁,将睾丸脂肪垫靠近附睾处固定在腹壁,关闭腹腔。3组均饲养75d后,切取睾丸进行形态学和组织化学比较。结果:实验组无死亡,切取睾丸时腹腔内未见粘连,模型对照组死亡率10%,腹腔内均见粘连。两组睾丸形态、大小相似,均较对照组小;形态学比较,实验组与模型对照组相似,管腔内未见成熟精子,与正常对照组比较,细胞形态改变相似;3β羟类固醇脱氢酶(3βHSD)染色显示实验组与模型对照组酶含量无显著性差异(P>0.05),较对照组低(P<0.01)。结论:这种新的方法操作简单,没有粘连,模型质量较经典的方法好。     

胶质细胞源性神经营养因子在小鼠生精恢复过程中的表达和意义

目的:分析并探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在小鼠恢复生精过程中的表达变化,及其与精原干细胞增殖与分化的关系。方法:间隔24 d 2次腹腔注射白消安建立小鼠生精恢复过程的动物模型。根据第二次给药后的不同时间随机分为1、2、3、4、6、8、10周共7组(8只/组),8只正常小鼠作对照组,分别于相应时点取材,进行光镜和电镜的研究。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时间GDNF mRNA的表达变化;并采用原位杂交技术检测GDNFmRNA表达定位。结果:2次给药后第1-2周,GDNF mRNA的表达明显增强,在第2周达到高峰;在给药后第3-4周明显下降,并在第4周达到低谷;随后几周内表达又逐渐增强,于第10周恢复到正常水平。原位杂交显示,GDNF由sertoli细胞表达。结论:在小鼠生精恢复过程中,GDNF的高水平表达促进精原干细胞自我更新,对于维持生精上皮干细胞数量的稳定具有十分重要的意义。