体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经胶质样细胞的实验研究

目的：观察体外以不同方法诱导的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)分化为神经胶质样细胞，探讨MSCs作为组织工程周围神经种子细胞的可行性。方法：以大鼠MSCs为研究对象，分化学诱导组，共培养诱导组，未经诱导的MSCs作为对照组。通过体外动态观察细胞形态，免疫细胞化学，western blot，RT-PCR等手段对各组诱导后的细胞进行鉴定。结果：形态学观察显示两种诱导过程中的部分MSCs细胞都出现明显的神经胶质细胞的形态，共培养诱导组的MSCs在诱导后仍可继续传代培养，对照组细胞形态无变化。细胞免疫组织化学染色，western blot和RT-PCR结果显示两个诱导组细胞都能够表达神经干细胞标志性抗体(Nestin)、神经胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和S-100抗体。结论：我们推断MSCs很有可能成为TEPN的理想种子细胞来源。     

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为预防牙体充填后出现牙髓刺激症状，我们自1996年起，应用Gluma脱敏剂对窝洞制备后的牙齿进行预处理。取得了较为满意的效果，现报道如下。     

脂肪组织来源干细胞复合胶原构建组织工程皮肤修复皮肤缺损

目的:探讨脂肪组织来源干细胞(ADSC)作为皮肤组织工程种子细胞修复皮肤缺损的可能性。方法:采用胶原酶消化SD大鼠脂肪组织,经体外扩增后接种于胶原凝胶构建组织工程活性皮肤替代物。15只SD大鼠随机分成3组:ADSC复合胶原组织工程活性皮肤替代物实验组、单纯胶原移植组和空白对照组。将各组相应材料分别移植于SD大鼠背部皮肤缺损处,比较观察创面修复效果。结果:ADSC复合胶原实验组、单纯胶原移植组和空白对照组创面愈合时间分别为:(14.3±1.7),(16.9±2.5)和(21.2±4.2)d,差异有显著性意义(P<0.05)。组织学观察显示,ADSC复合胶原实验组成纤维细胞、微血管、胶原纤维均较单纯胶原移植组和空白对照组明显增多。结论:ADSC复合胶原构建的组织工程活性皮肤替代物移植后可加速新生血管形成、促进创面修复。提示以ADSCs作为种子细胞复合胶原构建的组织工程皮肤可用于皮肤缺损的修复治疗。     

神经再生相关营养因子的提取及生物学特性检测

目的 提取神经再生微环境中的神经再生营养活性物质.方法 取York猪暴露坐骨神经,截断后缝接入硅胶管中,形成神经再生室,吸取硅胶管内液体,凝胶柱层析分离纯化神经再生液,雪旺细胞(SC)增殖实验检测所提取的神经再生营养因子的活性.结果 凝胶层析分离神经再生室内液体可得到2个峰,经检测2号蛋白峰可以促进SC增殖.结论 神经再生液中的提取物具有神经营养功能,可用于周围神经修复.     

生物活性皮肤替代物的超微结构观察

目的 :观察所培养的生物活性皮肤替代物的超微结构。方法 :以 5月龄胎儿的背部皮肤作为细胞来源 ,在牛I型胶原凝胶中立体培养成纤维细胞 ,3d后在凝胶表面接种表皮细胞 ,2d后将培养的皮肤替代物移至培养液气液面 ,促进上皮层的成熟和角化。观察HE染色后的人工皮肤组织学结构以及透射电镜下的超微结构。结果 :所培养的生物活性皮肤替代物同时含有表皮层和真皮层。表皮层中含有基底层、棘层、颗粒层和角质层。透射电镜观察结果显示 ,生物活性皮肤表皮层中 ,棘层细胞之间以桥粒连接 ,并具有天然皮肤中的板层体、张力纤维和脂滴等结构。结论 :生物活性皮肤替代物具有与天然皮肤类似的各种超微结构 ,为进一步的临床应用提供了实验依据     

组织工程活性皮肤在供皮区创面的应用效果

目的:组织工程活性皮肤应用于供皮区创面的有效性及安全性检测。方法:选取西安铁路中心医院烧伤整形科2003/2004需植皮患者16例,供皮区部分创面采用组织工程全层皮肤覆盖,选取邻近创面作为对照,对照区采用凡士林油纱布覆盖。治疗期间观察创面有无炎症反应、有无渗出及疼痛的轻重情况;随访1个月,对患者创面进行有效性及安全性评估:观察创面的愈合情况及不良反应,以能否揭出纱布为愈合指标,计算应用部位与对照的愈合时间。结果:按实际处理分析,纳入患者20例,进入结果分析16例。①创面愈合情况:患者术后病情平稳,创面无明显炎性反应及渗出,可见组织工程皮肤在创面存活,创面愈合时间与对照相比明显缩短2～4d。愈后未发现任何副作用。②平均愈合时间:应用区域短于对照区域[(7.51±1.68),(9.24±2.84)d,P<0.05]。结论:应用组织工程皮肤可促进供皮区的愈合,更快的治愈供皮区创面,明显缩短平均愈合时间,降低患者的疼痛、水疱形成等不良反应的发生率;为组织工程皮肤的临床应用提供了切实可行的方法。     

犬脂肪间充质干细胞体外分离培养及其多向分化潜能

目的:为进一步分析脂肪间充质干细胞的生物学特性,建立犬脂肪间充质干细胞的体外分离培养方法,并对其表面标志和多向分化潜能进行鉴定。方法:实验于2006-09/2007-04在解放军第四军医大学组织工程中心完成。①实验方法:1岁龄家犬麻醉后,无菌条件下取犬腹股沟皮下脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化,离心弃上层脂肪及上清,沉淀用含体积分数为0.1胎牛血清的D/F12培养基制成单细胞悬液,按2×108L-1接种于培养瓶中,细胞长满80%时用胰酶消化传代。②实验评估:分别取第3,5,10代脂肪间充质干细胞,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化;MTT法检测细胞增殖活性;采用免疫细胞化学和体外诱导分化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志和多向分化潜能进行鉴定。结果:①细胞形态观察:原代培养1d多数贴壁细胞呈圆形;3d时贴壁细胞数量明显增加,大部分呈梭形、三角形;6d后细胞呈团簇状生长,形成集落;9～10d后细胞融合超过80%。传代后2～4h开始贴壁,经过较短的潜伏期后开始增殖,3d即可长满培养瓶底壁。②细胞增殖活性:培养的细胞分裂增殖能力强,无明显的生长滞缓期,第3天进入对数生长期,第7天达到生长峰值,第8天后进入平台期。第3,5,10代细胞传代接种后的潜伏期、对数生长期、平台期无明显差异,传10代后细胞无明显的衰老征象。③细胞表面分子标志的鉴定:第3代脂肪间充质干细胞CD29,CD44均呈阳性表达。④脂肪间充质干细胞的多向分化潜能:向脂肪细胞诱导第6天胞质中出现透亮的小脂滴,油红染色呈阳性;向神经细胞预诱导24h后,细胞由梭形变为栅栏样,正式诱导0.5h后细胞呈双极或多极,3h后细胞形态不再发生变化,神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性;向成骨细胞诱导第21天可见钙化结节。结论:体外分离培养的犬脂肪间充质干细胞生长稳定、增殖较快,存在脂肪组织来源干细胞的相关标志分子CD29及CD44,诱导后能向脂肪细胞、神经细胞和成骨细胞分化。     

构建神经再生室培养成年SD大鼠许旺细胞

目的:探讨从成年SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量许旺细胞的有效手段。方法:实验于2005-05/11在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①取成年SD大鼠1只截断坐骨神经5mm,缝接入20mm硅胶管中,形成神经再生室。7d后重新打开伤口,刨开硅胶管,截取再生室内神经段置离心管中作为实验组。②取SD仔鼠5只,无菌条件下取双侧坐骨神经混合于离心管中作为对照组。③将两组坐骨神消化培养。通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了许旺细胞增殖和纯化程度。结果:①两组培养的细胞光镜观察结果:实验组的许旺细胞密度高于对照组,特别是在培养4d后细胞的密度差别尤为显著。实验组的许旺细胞密度大于600个/mm,而对照组密度不足200个/mm。②两22组许旺细胞免疫组织化学染色:实验组衬染后计数许旺细胞的纯度为(98.0±1.2%,对照组许旺细胞的纯度为(93.0±2.1)%(P<0.05)③)而。两组细胞的生长曲线:培养7d,实验组细胞数量较对照组明显增加,达到(49.6±3.5)×10L-1,远高于对照组的(31.7±3.9)×10L。77-1结论:从成年SD大鼠坐骨神经分离培养方法能获得大量高纯度的许旺细胞,为自体许旺细胞在修复周围神经缺损中的应用提供了可能。     

脱细胞猪角膜的制备及其生物学性能观察

目的制备脱细胞猪角膜（DPC）并观察其生物学性能。方法用高渗盐溶液浸泡、低浓度酶消化、冻干的方法制备DPC。对比观察DPC、人羊膜（HAM）、兔角膜（RC）的光学特性和机械强度,阿贝折射仪测量折射率,PE分光光度计测量透射率,小型英斯特朗仪测量抗拉强度和弹性模量。结果折射率DPC为1.331 3、HAM为1.332 2、RC为1.334 0;透射率DPC为70%、HAM为72%、RC为92%;抗拉强度DPC为2.4 mPa、HAM为3.6mPa、RC为4.5 mPa;弹性模量DPC为3.8 mPa、HAM为0.78 mPa、RC为5.3 mPa。三种材料的折射率相比,P〉0.05;DPC与HAM的透射率相比,P〉0.05;三种材料的抗拉强度和弹性模量相比,P均〈0.05。结论成功制备了DPC,DPC具备与HAM相似的光学特性,DPC有其自身独特的力学特性,能耐受手术缝合。     

Gluma脱敏剂在活髓牙保存治疗中的应用

为预防牙体充填后出现牙髓刺激症状,我们自1996年以来应用Gluma脱敏剂对窝洞制备后的牙齿进行预处理,取得了比较满意的结果。 1 临床资料 1.1 一般情况 门诊患者56例,共82个患牙,其中中龋74个,深龋8个,均表现为不同程度的冷热