透明质酸修饰壳聚糖/pDNA纳米微球的制备及体外转染软骨细胞

目的 以透明质酸(HA)修饰基因载体壳聚糖(CS)纳米微球,制作一种新型的HA/CS/pDNA基因转染系统,观察其结构特征及体外对软骨细胞的转染能力.方法 将不同比例的HA和CS与负载增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的质粒DNA(pDNA)以复凝聚法制成纳米微球,以扫描电镜检测纳米微球形态,Zeta电位粒度分析仪测定其粒径、表面电位;凝胶电泳阻滞实验观察CS和pDNA的结合力;体外转染兔关节软骨细胞,以流式细胞仪及荧光显微镜检测转染效率.结果 HA/CS/pDNA纳米微球多呈球形,粒径为(223±51)nm,表面Zeta电位为(17.4±6.1)mV,可有效保护pDNA免受 DNaseⅠ的降解.体外转染实验证明HA/CS/pDNA纳米微球能介导pEGFP转染软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白,转染率达(15.450±0.404)%,比裸pDNA组和CS/pDNA组有更高的转染效率(P<0.05).结论 复凝聚法制备的HA/CS/pDNA纳米微球是一种有效的新型非病毒基因转染系统,对软骨细胞有着潜在的靶向基因转染能力.

Abstract：

Objective To prepare hyaluronic acid (HA)-modified chitosan (CS)/pDNA (HA/CS/pDNA) nanoparticles as novel gene vectors, study their structural characteristics and gene transfection efficiency for chondrocytes in vitro in rabbits. Methods The HA/CS/pDNA nanoparticles were prepared by a DNA (pDNA), which load enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene. The morphology of the nanoparticles was observed under the transmission electron microscopy. The sizes and zeta-potentials of the nanoparticles were measured by a Marven-nano laser diffractometer. The binding of pDNA was evaluated by agarose gel electrophoresis analysis. The gene transfection experiments in vitro were performed with the chondrocytes of rabbits. The gene transfection efficiency was measured by using flow cytometry and under the fluorescence microscopy. Results HA/CS/pDNA nanoparticles were mainly spherical, with an average size of (223±51) nm, and zeta-potential of (17.4±6.1) mV. The agarose gel electrophoresis analysis confirmed that they could effectively protect pDNA from degradation against DNase I. Gene transfection in vitro proved that HA/CS/pDNA nanoparticles could be efficiently transfected into chondrocytes of rabbits, the expression of green fluorescent proteins was observed under the fluorescent microscopy, and the transfection efficiency reached as high as (15.450±0.404)%, significantly higher than that of the naked pDNA or the CS/pDNA nanoparticles (P<0.05). Conclusion HA/CS/pDNA nanoparticles were an effective novel non-viral gene transfer vector, which possessed the potential targeting transfection ability on chondrocytes.     

空心加压螺钉治疗股骨颈骨折疗效分析

目的：探讨空心加压螺钉内固定术治疗股骨颈骨折的疗效及术后致股骨头缺血性坏死的相关影响因素。方法：对2003年1月至2009年6月应用空心加压螺钉治疗的96例股骨颈骨折进行回顾性分析,男44例,女52例;年龄21～88岁,平均56.3岁。将患者年龄、性别、骨折类型、骨折复位情况、外伤至手术复位时间与术后骨折不愈合及股骨头缺血性坏死之间的关系进行统计学分析。结果：84例获得随访,时间9～60个月,平均25.4个月。术后出现下肢深静脉血栓2例,骨折不愈合8例,股骨头缺血性坏死11例。术后Harris评分为（86.20±11.00）分,优40例,良32例,可7例,差5例。未移位骨折组和移位骨折组股骨头坏死发生率分别为3.22%和18.87%,两者差异有统计学意义（P=0.037）;解剖复位组和非解剖复位组的股骨头坏死发生率分别为5.00%和20.45%,两者差异有统计学意义（P=0.036）;而不同年龄、性别、手术时间对继发股骨头坏死无明显差异。结论：空心加压螺钉内固定术治疗无移位股骨颈骨折疗效良好,骨折类型及骨折复位情况是影响术后股骨头缺血性坏死的主要因素。对年轻移位的股骨颈骨折患者,应尽可能解剖复位、牢靠内固定,以减少术后股骨头缺血性坏死的发生;对于骨折移位严重的高龄患者,建议行人工关节置换术。     

轴向椎体间融合术微创治疗腰骶椎失稳症

目的 评价轴向椎体间融合术(AxiaLIF)微创手术治疗L5/S1失稳症的临床有效性和安全性. 方法 采用尾骨尖旁2 cm切口,在G臂X线透视下,经骶椎前方建立工作通道,骨性通道入口在S1～2之间,用特殊工具经轴向的工作通道切除椎间盘、植骨,最后拧入长度合适的轴向固定螺栓.治疗12例L5/S1失稳症,观察手术时间、术中出血量、围手术期并发症以及随访观察椎间融合情况,并采用视觉模拟评分(VAS)和Oswestry功能障碍指数(ODI)评价手术前后患者症状改善情况. 结果 手术时间30～70min,术中出血50～90 ml,无并发症发生.所有患者于术后第2天戴腰围活动.随访时间3～9个月,VAS和ODI分别由术前6.66±0.89和61.18±7.93降至术后3个月2.08±0.79和21.51±3.63,差异有统计学意义.术后融合情况:1例于术后6个月完全融合,10例部分融合,1例尚未见融合. 结论 轴向椎体间融合术手术创伤小,并发症少,术后恢复快,为L5/S1节段提供一个安全而微创的椎体间融合方式.     

rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs诱导分化为软骨细胞的研究

目的 探讨rAAV2-hTGF-β1体外转染犬MSCs定向分化为软骨细胞的可行性.方法 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSCs,倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态,流式细胞技术鉴定其表面标记物.取第三代MSCs,分别以感染复数(MOI)为1×105病毒基因数/细胞v.g./cell)、5×105v.g./cell的rAAV2-hTGF-β1进行转染.培养后定期取各组细胞进行相关检测.Western blot检测hTGF-β1的表达,ELISA法测定hTGF-β1的含量,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA的表达,免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达.结果 原代及传代培养的MSCs呈梭形外观,具有较强的增殖能力.细胞表面抗原CD29、CD44、CD105表达阳性,CD34、CD45表达阴性.rAAV2-hTGF-β1转染MSCs后,Western blot法检测到目的 蛋白hTGF-β1稳定表达:ELISA法检测转染组MSCs培养上清液中的hTGF-β1表达,且随时间的延长,各组hTGF-β1浓度逐渐增加,MOI 5×105组表达量明显高于MOI 1×105组(P<0.01);RT-PCR检测到各转染组Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA表达,免疫细胞化学法检测转染组细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达,且高MOI值组表达强度明显高于低MOI值组.结论 rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs后可定向分化为软骨细胞,作为软骨组织工程的种子细胞是可行的.     

医用TH胶栓塞建立月骨缺血性坏死兔模型

背景：目前缺乏与人类月骨缺血性坏死病理过程类似的Kienb？ck病动物模型。〈br〉 目的：采用医用TH胶栓塞法建立一种新型月骨缺血坏死兔模型,并探讨造模方法的合理性。〈br〉 方法：选择健康成年新西兰兔30只,雌雄不限。采用自身对照方法随机分为实验侧和对照侧,实验侧采用月骨中心钻孔,注射医用TH胶0.2 mL,反复注药3次;对照侧月骨中心钻孔注射同等量的生理盐水。于实验4,8,12周行X射线、大体观察、Micro-CT 骨计量学及组织病理学检测。 结果与结论：大体标本、X射线及组织学检测结果可见实验侧造模后8周月骨出现缺血坏死表现,12周月骨缺血坏死更为典型。Micro-CT 骨小梁微观参数中,实验侧骨小梁密度参数骨体积分数及骨小梁数量均明显低于对照侧（P＜0.05）;骨小梁空间参数明显增高,其中实验侧骨小梁离度及结构模型指数明显高于对照侧。提示注射医用TH胶栓塞后8周实验侧出现月骨缺血坏死表现,注药后12周可建立月骨缺血坏死兔模型,可以实现在周围组织无明显损伤情况下出现月骨内血运受损、骨小梁骨折、空骨陷窝等与人类月骨坏死类似的改变。     

经颅穿刺治疗颅内血肿60例分析

微创手术自 1967年贾保祥教授首先应用于临床 ,至今已有3 0余年历史 ,至 90年代ＹＬ -Ⅰ型颅内血肿粉碎穿刺针成功研制 ,使该项技术更趋成熟 ,简便 ,易于掌握。本院于 1998年引进该项技术 ,成功治疗 60例颅内血肿患者 ,疗效较满意。1　临床资料1 1　一般资料　本组男 3 5例 ,女 2 5例 ,年龄最大 89岁 ,最小 3 1岁 ,平均 5 8 8岁。1 2　出血原因和疾病种类　高血压 41例 ,脑外伤引起慢性硬膜下血肿 15例 ,脑血管畸形 4例。1 3　出血量及出血部位　出血量最大 12 0ｍｌ,最小 40ｍｌ ,平均75ｍｌ。出血部位 :基底节区出血 14例 ,脑叶出血 2 0例…     

不采用术中X线定位的后路椎间盘镜髓核摘除术治疗腰椎间盘突出症

目的探讨后路椎间盘镜手术中不采用X线定位的可行性。方法269例腰椎间盘突出症患者行后路椎间盘镜髓核摘除术,不采用X线进行术中定位。根据术前腰椎平片,通过骨性标志的触摸和术中细针穿刺确定手术间隙并建立工作通道,术中可根据手术情况适当调整工作通道位置。结果手术时间30～90min,269例患者中,267例首次置入工作通道定位准确,2例术中发现定位错误（神经根松弛无间盘突出）,移动工作通道完成手术,无需重新切口。术后所有患者腰腿痛症状消失或缓解,复查X线照片未发现手术节段错误。并发马尾神经损伤1例,单纯脑脊液漏4例,切口愈合不良2例。结论参照腰椎平片,通过骨性标志的仔细触摸和术中细针穿刺定位,不采用术中X线定位的后路腰椎间盘镜手术确实可行,并节省术中定位时间,避免患者和医护人员的射线接触。     

人骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

目的：探讨应用壳聚糖支架三维立体培养人骨髓基质干细胞(mesenchvmal stem cells，MSCs)，体外诱导其分化成为软骨细胞的可行性。方法：实验于2004—02／11在中山大学附属第三医院中心实验室完成。相分离法制备三维多孔壳聚糖支架，检测支架的孔隙率、孔径。抽取人骨髓，密度梯度离心法分离纯化，体外培养扩增。将第3代MSCs复合于支架中培养，应用无血清诱导液诱导细胞向软骨细胞分化，通过组织学染色及扫描电镜观察细胞的形态、增殖及功能的改变。结果：通过相分离法可制备出高孔隙率的三维壳聚糖支架，孔隙率达86．5％，孔隙分布均匀且相互连通，平均孔径182μm。诱导分化的MSCs在支架中贴附良好，呈现典型的软骨细胞形态，并有细胞外基质分泌：结论：人MSCs在三维立体培养环境下可诱导分化为软骨细胞，作为种子细胞在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用价值。     

糖化血红蛋白对急性缺血性脑卒中预后的影响

目的 探讨糖化血红蛋白(HbAlc)与急性脑梗死(ACI)患者病情严重程度及预后的影响.方法 收集急性动脉粥样硬化性脑梗死患者269例,分为HbAlc正常组128例和HbAlc升高组141例,观察ACI预后.结果 HbAlc升高组神经功能缺损评分、脑梗死损伤程度明显高于HbAlc正常组.结论 糖化血红蛋白是评估患者预后的有效指标之一,高HbAlc水平与ACI预后不良有关.