Persephin基因转染对缺氧诱导神经干细胞凋亡的影响

背景:如何抑制或减少神经干细胞凋亡的发生,促进缺氧后神经干细胞的存活,成为脑梗死神经干细胞移植治疗的研究热点。目地:观察在缺氧状态下转染人类persephin基因对神经干细胞凋亡的作用。设计:完全随机分组,对照实验。单位:中山大学附属第二医院神经内科。材料:实验于2006-07/2006-12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成,重组腺病毒pAd persephin由本实验室构建保存,C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠。胰蛋白酶、DMEM/F12购自Gibco公司;胎牛血清来自杭州四季青生物工程公司;多聚赖氨酸购自美国Sigma公司;TUNEL检测试剂盒,阳离子脂质体FuGENE购自瑞士Roche公司;S-P免疫组化试剂盒及DAB显色剂购自福建迈新生物工程公司;鼠抗人Nestin单抗,Persephin兔抗人多抗购自美国Santa Crus公司,persephin反义寡核脱氧苷酸由上海生工合成。方法:①实验干预:将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,分为4组,A组:正常对照组,C17.2神经干细胞不作缺氧处理。B组:缺氧处理组,即置于37℃、体积分数0.95N2,体积分数0.05CO2厌氧培养箱培养。C组:缺氧 pAdpersiphin转染组,即:将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,pAdpersiphin转染48h后的细胞置同B组条件的厌氧培养箱培养。D组:缺氧 pAdpersiphin转染组 persiphin反义寡核脱氧苷酸,即pAdpersiphin persiphin反义寡核脱氧苷酸转染。②实验评估:Western-blotting法分析Persephin蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。主要观察指标:Persephin蛋白的表达、细胞凋亡指数和凋亡率。结果:①Persephin蛋白表达:C组细胞经Western blot检测可见一特异性蛋白条带存在,Mr约为24000,符合预期结果,说明persiphin成功表达,D组亦可见一Mr 24000的条带,但条带较单纯pAdpersiphin感染组明显为淡,说明反义persiphin反义寡核脱氧苷酸可成功抑制pAdCMVpersiphin的表达。②细胞凋亡指数:C组凋亡细胞明显减少,凋亡指数低于B、D组(P<0.01),但高于A组(P<0.01),表明细胞凋亡未完全避免。③细胞凋亡率:B、D组凋亡率明显高于A组(P<0.01),C组明显较B组、D组低(P<0.01)。结论:腺病毒介导的Persephin基因能高效表达Persephin;外源性Persephin对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性。     

NURR1基因修饰C17.2神经干细胞移植治疗脑梗死

目的:比较C17.2神经干细胞和NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对脑梗死模型鼠神经功能缺损的改善效果,观察细胞移植后与宿主脑组织的整合、存活、移行及分化情况。方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。①实验材料:选取清洁级健康SD雄性大鼠78只,随机数字表法分为模型对照组、神经干细胞组、转基因神经干细胞组,26只/组。条件永生化神经干细胞系C17.2由哈佛大学儿童医院Even Synder教授惠赠。pAdeasy-NURR1重组复制缺陷性腺病毒由本实验室成功构建。Dil18荧光染料(Chemicon公司产品)。②实验方法:收集C17.2神经干细胞和pAdeasy-NURR1 C17.2神经干细胞,各分为两管,一管加入Dil18荧光示踪剂。各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,3d后进行细胞移植,以江湾Ⅱ型脑立体定向仪进行立体定位,选择缺血半暗区3个位点为移植区:前囟头侧1mm,旁开2mm,深度1.2mm;前囟尾侧3mm,旁开1.5mm,深度1.2mm;前囟尾侧6mm,旁开2mm,深度1.2mm。模型对照组每位点注射单纯培养液2μL;神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的C17.2神经干细胞悬液2μL,剩余20只每位点移植C17.2神经干细胞悬液2μL;转基因神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的pAdeasy-NURR1 C17.2神经干细胞悬液2μL,余20只每位点移植pAdeasy-NURR1 C17.2神经干细胞悬液2μL。③实验评估:各组大鼠分别在移植前1d及移植后1周、2周、1个月进行神经功能缺损评分。移植后1周、2周、1个月进行荧光示踪检查及神经元特异烯醇化酶免疫组化检测。移植后6个月行组织学检查。结果:移植后1周,模型对照组死亡1只,神经干细胞组死亡2组,转基因神经干细胞组死亡2只,均淘汰并予以补充。①神经功能缺损评分:移植前1d各组大鼠神经功能缺损评分基本相似(P>0.05)。移植后1周、2周、1个月神经干细胞组、转基因神经干细胞组神经功能缺损评分均明显低于模型对照组(P<0.05);转基因神经干细胞组下降趋势较神经干细胞组更为显著(P<0.05)。②Dil18荧光细胞示踪结果:移植后1周荧光示踪细胞主要在针道内,少数细胞开始移行至周围神经组织。移植后2周,细胞移行至更远距离,并明显向梗死灶方向移行,细胞有突触样结构与周围细胞形成联系。移植后1个月细胞向周围扩散,甚至在远隔部位也可见荧光细胞。③神经元特异烯醇化酶免疫组化检测结果:移植后2周、1个月,转基因神经干细胞组神经元特异烯醇化酶阳性细胞数均明显高于神经干细胞组(P均<0.05)。④细胞组织学检查:移植后6个月,各组大鼠注射针道周围脑组织仍呈正常的层次和结构,未见有明显异型细胞增生。结论:①NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗局灶性脑梗死能显著改善神经功能缺损,效果优于C17.2神经干细胞。②移植后供体细胞存活并向注射针道周围神经组织移行,促进神经干细胞向神经元方向的分化。     

氧葡萄糖剥夺-再恢复后抑制小胶质细胞TLR9激活对神经元的保护作用

目的:观察氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)后小胶质细胞BV-2 Toll样受体9(TLR9)激活对神经元凋亡的影响。方法:对BV-2细胞或TLR9-siRNA转染的BV-2细胞进行OGDR处理4 h后,将细胞上清添加至OGDR处理4 h的小鼠原代皮层神经元中,继续正常培养24 h后,倒置显微镜下观察神经元形态变化,TUNEL染色检测神经元凋亡,Western blotting检测神经元caspase-3蛋白的表达。实验分为正常BV-2组、negative control-siRNA组、TLR9-siRNA组、OGDR组、OGDR+NC-siRNA组、OGDR+TLR9-siRNA组和对照组(神经元OGDR后不添加BV-2细胞上清)。结果:OGDR后神经元胞体肿胀,折光性下降,出现空泡样变,轴突变细、扭曲、断裂。TUNEL染色各组均可见绿染凋亡小体。与对照组比较,其它组的caspase-3蛋白表达升高(P0.05);与正常BV-2组比较,OGDR组和TLR9-siRNA组的caspase-3蛋白表达升高(P0.05);OGDR+TLR9-siRNA转染组与TLR9-siRNA转染组和OGDR组比较,caspase-3蛋白表达下降(P0.05)。结论:OGDR后BV-2细胞TLR9激活致神经元凋亡增多,caspase-3蛋白表达升高;抑制TLR9表达后,神经元损伤减轻。     

曲伏前列素联合布林佐胺治疗原发性开角型青光眼的临床疗效及安全性

目的 探讨曲伏前列素联合布林佐胺治疗原发性开角型青光眼（POAG）的临床疗效及安全性。方法 选取2016年1月~2018年12月我院收治的POAG患者112例,采用随机数字表法分为对照组和观察组,每组56例。对照组给予曲伏前列素滴眼液治疗,观察组在对照组基础上给予布林佐胺滴眼液。比较两组平均眼压、昼夜眼压差、临床疗效及不良反应。结果 治疗后,观察组平均眼压和昼夜眼压差均低于对照组[（16.26±2.14）mmHg vs（17.70±2.66）mmHg]、[（1.89±0.52）mmHg vs（2.33±0.56）mmHg],差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组总有效率为96.43%,高于对照组的75.00%,差异有统计学意义（P＜0.05）。两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 曲伏前列素联合布林佐胺治疗POAG临床疗效确切,可有效降低眼压,稳定昼夜眼压,不增加不良反应。     

经颅多普勒超声动态评价他汀类药对急性缺血性卒中脑血流动力学的影响

目的:评价他汀类药对存在颅内血管狭窄的急性缺血性卒中患者脑血流动力学的影响。方法:入选存在颅内血管狭窄的急性缺血性卒中患者161例,根据是否规律服用他汀类药(阿托伐他汀钙,20 mg/d),将其分为用药组(83例)与非用药组(78例)。入院1周内完成经颅多普勒超声(TCD)脑血流动力学评价,再分别于发病后4周和12周时再经TCD复查两组患者脑血流动力学情况。结果:与入院1周内的脑血流动力学情况比较,用药组患者的大脑中动脉(MCA)脑血流动力学逐步改善,在4周时差异无统计学意义,但12周时差异达到统计学意义(P<0.05);发病后4、12周两次复查,用药组患者对MCA狭窄的改善均高于非用药组,但这种差异只在发病12周时差异达到统计学意义(P<0.05)。结论:他汀类药对改善存在颅内血管狭窄的急性缺血性卒中患者的脑血流动力学有一定作用。     

肾性高血压大鼠脑梗死后期的基因表达谱分析

目的 利用基因芯片技术研究肾性高血压大鼠脑梗死后期梗死灶边缘区皮层基因表达谱的改变及其意义.方法 利用双肾双夹法复制肾性高血压大鼠模型,再采用线栓法复制成大脑中动脉闭塞模型,并设置假手术组,术后7 d取梗死灶边缘区域脑皮层,提取RNA,经过荧光标记后与含5705个基因的oligo芯片进行杂交、扫描,采集图像,经数据分析筛选出差异表达的基因.结果 差异表达基因共197个(包括表达序列标签12个),其中表达上调174个,下调23个.12类功能分组的基因均有上调,下调的基因仅包括运输、转录调控、信号、应激反应、代谢和细胞粘附组的基因.12类功能分组中有17个差异表达基因尚未有文献报道与脑缺血/梗死相关.结论 脑梗死后期基因表达仍然非常活跃,预示着损伤与修复的分子机制和可能的治疗靶点.     

rt-PA静脉溶栓后合并SICH一例报道及分析

急性缺血性卒中（AIS）使用重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）静脉溶栓治疗是经过大量临床随机对照试验和大型临床观察性研究证实的最有效治疗手段。然而,出血转化（HT）是静脉溶栓治疗最重要的并发症,尤其是症状性颅内出血（SICH）会显著影响患者的预后。笔者现报道并分析急性脑梗死患者应用rt-PA静脉溶栓治疗后合并SICH1例,希望对基层临床医生有所启示。     

速避凝治疗急性脑梗死的临床观察

目的:观察速避凝对急性脑梗死的疗效与安全性。方法:采用单盲、随机对照方式,将97例急性脑梗死患者分为治疗组51例,对照组46例。其中对照组用传统治疗,治疗组除传统治疗外,加用速避凝治疗10天。观察两组的治疗效果及副作用。结果:治疗组总有效率为88.25％,与对照组的63.03％比较有明显差异(P<0.05);治疗后全血粘度、血浆粘度、红细胞压积、血小板粘附率都有明显改变(P<0.05)。无继发出血等副作用。结论:速避凝治疗急性脑梗死疗效好,副作用少。     

SPECT评估脑梗死后远隔功能抑制与预后的关系

目的:大脑半球卒中后运动功能的恢复不仅包括运动区、运动前区的重组,还和远隔区域的变化相关。本文旨在探讨单光子发射计算机断层显像(single photon emission computed tomography,SPECT)观察到的亚急性期幕上脑梗死患者远隔区域低灌注程度与卒中预后的关系。方法:选择首次发病的单侧幕上脑梗死患者,于亚急性期(5～14天)进行SPECT脑血流灌注显像,若发现存在远隔区功能抑制,对远隔区的放射性计数进行半定量分析,按如下公式计算远隔区域脑血流的不对称指数(AI):[(正常区域放射性计数-远隔区域放射性计数)/正常区域放射性计数]×100。入组患者根据不对称指数分为轻度(AI≤5)、中度(510)组。发病60天后使用斯堪的纳维亚神经卒中量表(SNSS)、恢复指数(RI)和Barthel指数(BI)对各组患者进行临床预后评估。结果:共收集首发单侧幕上脑梗死后发生远隔功能抑制现象的病例66例,其中轻度组23例,中度组27例,重度组16例。三组之间的恢复指数、Barthel指数具有显著的统计学差异。恢复指数与反映远隔区域脑血流的不对称指数之间具有显著的负相关性(r=-0.564,P<0.01),Barthel指数与不对称指数亦具有显著的相关性(r=-0.552,P<0.01)。结论:幕上脑梗死患者亚急性期远隔区域低灌注程度在神经功能恢复中具有重要意义。SPECT可作为临床上低灌注程度测定的可靠方法。