原发性肝癌中Tec的表达及其磷酸化水平

目的用高通量的组织芯片技术，分析人正常肝组织、癌旁肝组织及肝癌组织中Tec的表达及磷酸化水平，探讨其表达差异的意义。方法用组织芯片技术结合免疫组织化学法检测肝癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织中Tec的表达及其磷酸化水平。结果Tec在肝癌组织及非癌组织中阳性表达率差异无统计学意义，但在肝癌组织中的染色程度显著强于非癌组织，且与组织分级有关（P〈0．05）。Tec磷酸化水平在肝癌组织（73％）高于癌旁组织（42％）及正常肝组织（10％），P〈0．05。结论Tec的表达异常与肝癌的发生发展密切相关，抑制Tec的表达或直接降低其磷酸化水平可能影响肝癌的进程。     

PD98059对肝癌HepG2细胞Tec信号转导作用的初步研究

目的探讨MEK1抑制剂PD98059对肝癌细胞株HepG2细胞中Tec(tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma)及ERK2作用.方法免疫细胞化学方法检测Tec、ERK2在HepG2细胞中的表达;用RT-PCR和Westernblot方法检测,不同浓度PD98059处理细胞后,HepG2细胞中的Tec、ERK2 mRNA及蛋白表达.结果Tec、ERK2在HepG2细胞中呈高表达,PD98059明显影响HepG2细胞Tec、ERK2 mRNA以及蛋白表达,呈剂量依赖性,40 μmol/LPD98059细胞抑制最明显.结论Tec可能是肝癌细胞内Ras/Raf/ERK信号转导途径上游的信号蛋白,与Ras/Raf/ERK信号转导通路存在着某种信号联系.     

视黄酸诱导蛋白16蛋白质结构功能分析

目的:分析Tec激酶区作用蛋白视黄酸诱导蛋白16(RAI16)的蛋白质结构和功能信息.方法:利用相应的计算机软件及数据库,对RAI16 cDNA序列进行分析和比较,并对编码的蛋白质氨基酸序列及其二级结构进行分析和预测.结果:RAI16 cDNA序列由2863个核苷酸组成,编码759氨基酸蛋白质,RAI16蛋白包括一段由31个氨基酸组成的信号肽,没有跨膜区,亚细胞定位于内质网上,有多种二级结构形式,为一紧密包裹的球状蛋白质,是一种分泌蛋白,有多个磷酸化和蛋白酶切位点.RAI16蛋白为不稳定蛋白,不稳定系数为53.11.疏水性GRAVY(grand average of hydropathicity)值为-0.136.结论:RAI16蛋白作为一种新的胞内信号蛋白,很可能在肝癌细胞的诱导分化信号转导转录中与Tec协同发挥重要作用.     

原发性肝癌不同病理组织类型中肝干细胞的分析***

背景：近年来,有观点认为原发性肝癌的发生机制可能为肝干细胞分化不全或分化异常所致。目前,肝干细胞研究正处于起步阶段,对人原发性肝癌的“干细胞起源”学说尚需进一步验证。 目的：观察原发性肝癌不同病理组织类型中肝干细胞的活化、分布、来源和免疫表达特征。 设计：观察对比实验。 单位：解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心。 对象： 实验于2003-09/2004-07在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心完成,选用94例肝细胞癌和12例肝内胆管细胞癌和10例混合型肝癌石蜡包埋组织,同时选用5例肝硬化和4例正常肝组织作为实验对照,均取自病理科存档资料。肝癌组织均为患者首次肝癌切除手术时采取,包括肿瘤组织和癌旁组织,患者均无化疗和放射治疗史,并对受检项目知情同意。实验主要抗体均购自Santa Cruz公司。 方法： 采用苏木精-伊红染色、免疫组织化学SP方法（检测的免疫标志有鼠抗人细胞角蛋白19单克隆抗体、鼠抗人细胞角蛋白7单克隆抗体、鼠抗人细胞角蛋白8&18单克隆抗体、鼠抗人c-kit单克隆抗体、鼠抗人Thy-1单克隆抗体、鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体）观察各病变类型肝干细胞免疫标志表达情况。 主要观察指标：各病变类型肝干细胞免疫标志表达情况。 结果：在原发性肝癌不同病理组织类型中干细胞免疫标志均有不同程度的表达,均可观察到肝干细胞向肝癌细胞的转化,以混合型肝细胞癌中肝干细胞免疫表型表达率最高(P < 0.05)。正常组和肝硬化组干细胞免疫表型特征为阴性。　 结论：不同病理组织类型的肝癌组织中均存在不同分化状态和不同来源的肝干细胞。     

原发性肝癌不同病理组织类型中肝干细胞的分析

背景：近年来，有观点认为原发性肝癌的发生机制可能为肝干细胞分化不全或分化异常所致。目前，肝干细胞研究正处于起步阶段，对人原发性肝癌的“干细胞起源”学说尚需进一步验证。目的：观察原发性肝癌不同病理组织类型中肝干细胞的活化、分布、来源和免疫表达特征。设计：观察对比实验。单位：解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心。对象：实验于2003-09／2004-07在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心完成，选用94例肝细胞癌和12例肝内胆管细胞癌和10例混合型肝癌石蜡包埋组织，同时选用5例肝硬化和4例正常肝组织作为实验对照，均取自病理科存档资料。肝癌组织均为患者首次肝癌切除手术时采取，包括肿瘤组织和癌旁组织，患者均无化疗和放射治疗史，并对受检项目知情同意。实验主要抗体均购自SantaCruz公司。方法：采用苏木精一伊红染色、免疫组织化学SP方法（检测的免疫标志有鼠抗人细胞角蛋白19单克隆抗体、鼠抗人细胞角蛋白7单克隆抗体、鼠抗人细胞角蛋白8＆18单克隆抗体、鼠抗人c—kit单克隆抗体、鼠抗人Thy—1单克隆抗体、鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体）观察各病变类型肝干细胞免疫标志表达情况。、主要观察指标：各病变类型肝干细胞免疫标志表达情况。结果：在原发性肝癌不同病理组织类型中干细胞免疫标志均有不同程度的表达，均可观察到肝干细胞向肝癌细胞的转化，以混合型肝细胞癌中肝干细胞免疫表型表达率最高（P〈0．05）。正常组和肝硬化组干细胞免疫表型特征为阴性。结论：不同病理组织类型的肝癌组织中均存在不同分化状态和不同来源的肝干细胞。     

Tec激酶区作用蛋白RAI16的筛选和结构功能分析

目的筛选与Tec激酶结构域相互作用的蛋白分子,并获得其蛋白质结构及功能信息.方法通过酵母双杂交技术筛选作用蛋白,利用相应的计算机软件及数据库,对筛库所得蛋白进行生物信息学分析.结果筛选得到1种Tec激酶区作用蛋白RAI16,其cDNA序列由2 863个核苷酸组成,编码759 aa蛋白质,具有多个功能基序,其中包括3个酪氨酸磷酸化位点.结论推测RAI16蛋白与细胞分化有关,很可能在肝癌细胞的诱导分化信号转导转录中与Tec协同发挥重要作用.     

MicroRNA在HepG2肝癌细胞表达差异谱的研究

目的 建立HepG2人肝癌细胞株与LO2正常肝细胞株microRNA(miRNA)表达的差异谱,为研究miRNA在肝细胞癌变机制中的作用提供新线索.方法 体外培养HepG2人肝癌细胞和LO2人正常肝上皮细胞,Trizol法抽提细胞总RNA,Ambion′s miRNA Isolation Kit进一步分离miRNA;利用基因芯片技术,将细胞miRNA与哺乳动物miRNA芯片杂交,采用LuxScan3.0 图像软件和SAM version 2.1进行数据分析.结果 HepG2细胞与LO2细胞表达的miRNA中有146个存在着明显差异(fold change >4.0),其中80个低表达和66个高表达,最高fold change达36倍,部分miRNAs与肿瘤关系密切,其中has-miR-224为肝癌癌变相关miRNA.结论 HepG2较LO2细胞miRNA低表达数多于高表达数,反映其基因表达数量更丰富,细胞代谢和增殖更活跃;部分miRNAs可能参与肝细胞癌变分子机制.     

Tec激酶区作用蛋白RAI16的原核表达和纯化

目的:利用原核表达系统构建Tec激酶区作用蛋白RAI16的融合蛋白表达载体,并进行表达条件的优化和初步纯化.方法:设计基因拼接引物,合成RAl16 cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的RAI16基因与pGEX4T-2载体相连接、转化、筛选.将鉴定阳性的重组子质粒转人大肠杆菌BL-21表达茵中,采用SDS-PAGE电泳分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白的表达.结果:成功构建RAl16蛋白原核表达栽体.采用0.4 mm01/L IPTG、30℃诱导4 h,获得较高表达目的蛋白.融合蛋白主要以包涵体形式表达,将包涵体进行尿素法变性复性和亲和层析柱处理后,获得可溶的高纯度GST-多肽融合蛋白.结论:Tec激酶区作用蛋白RAl16融合蛋白表达的载体和纯化.是制备RAl16多抗以及进一步验证与Tec体外结合作用实验的基础.     

原发性肝癌不同病理组织类型中肝干细胞的起源分析

目的观察原发性肝癌不同病理组织类型中肝干细胞的活化、分布、来源和免疫表达特征.方法应用HE染色、免疫组化S-P方法观察94例肝细胞癌(HCC)和12例肝内胆管细胞癌(ICC)和10例混合型肝癌的肝干细胞情况,用5例肝硬化和4例正常肝组织为对照.结果在原发性肝癌不同病理组织类型中干细胞免疫标志均有不同程度的表达,均可观察到肝于细胞向肝癌细胞的转化,以混合型肝细胞癌中肝于细胞免疫表型表达率最高(P＜0.05).结论不同病理组织类型的肝癌组织中均存在不同分化状态和不同来源的肝干细胞,可能由于肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)分化不全或分化异常所致.