靶向小鼠核因子κB P65的小干扰RNA逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向小鼠核因子κB（NF-κB）P65进行RNA干扰（RNAi）的逆转录病毒载体,鉴定其生物学效应。方法采用分子克隆技术构建靶向小鼠NF-κB P65 siRNA的逆转录病毒载体,转染293E细胞,包装成逆转录病毒,以不同滴度感染小鼠单核巨噬细胞J774A.1,用相同浓度的脂多糖（LPS）刺激,在不同时间点用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平上检测细胞NF-κBP65表达,并用RT-PCR和ELISA方法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达。结果成功构建靶向小鼠NF-κB P65基因的小干扰RNA逆转录病毒表达载体。经LPS刺激后,siRNA病毒组J774A.1细胞中NF-κB P65 mRNA的表达明显受到抑制,2 h即明显低于Scramble病毒组（0.91±0.03比1.02±0.02,P〈0.01）,此后持续降低;在LPS刺激后的24、36、48和72 h,siRNA病毒组NF-κB P65蛋白表达均明显低于Scramble病毒组（0.97±0.02比1.01±0.01,0.94±0.01比1.02±0.01,0.94±0.02比1.02±0.01,0.93±0.01比1.00±0.02,P〈0.05）。LPS刺激后2、6、12和24 h,siRNA病毒组TNF-α的mRNA表达水平均明显低于Scramble病毒组（P〈0.01）,而相同时间点siRNA病毒组细胞上清TNF-α的含量亦明显低于Scramble病毒组（P〈0.01）。结论将小干扰RNA片段连接到空白质粒中构建逆转录病毒表达载体的方法是可行的。采用RNA干扰技术抑制NF-κB的表达后,可以减少其下游炎症因子的释放,提示RNA干扰技术在炎性损伤性疾病如急性肺损伤的防治中具有潜在应用价值。     

小干扰RNA干扰核因子κB信号通路对内毒素刺激巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α的影响

目的 探讨小于扰RNA(siRNA)抑制核因子κB(NF-κB)信号通路对细菌脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响.方法 人单核细胞白血病THP-1细胞经氟波酯诱导为巨噬细胞后分2组,分别感染应用分子克隆技术构建的针对NF-κB P65的siRNA逆转录病毒质粒(siRNA病毒组)及乱序(Scramble)对照序列逆转录病毒质粒(Scramble病毒组).用终浓度50μg/ml的LPS持续刺激2组巨噬细胞,分别应用RT-PCR技术检测LPS刺激不同时间巨噬细胞NF-κB P65 mRNA和TNF-α mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测NF-κB P65蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验检测巨噬细胞培养上清液TNF-α含量.结果 LPS刺激12和24 h,siRNA病毒组巨噬细胞NF-κB P65 mRNA表达水平(0.97±0.02,0.89±0.01)明显低于Scramble病毒组(1.01±0.03,0.97±0.01,均P＜0.05);LPS刺激24和72 h,siRNA病毒组NF-κB P65蛋白表达水平(0.95±0.04,0.94±0.01)明显低于Scramble病毒组(1.07±0.06,1.03±0.05,均P＜0.05).LPS刺激4、8、12和24 h的各时点,siRNA病毒组TNF-α mRNA表达水平均明显低于Scramble病毒组(0.92±0.02比0.98 ±-0.01,0.86±0.02比1.00±0.01,0.79±0.03比1.01±0.01,0.78±0.03比1.02±0.01,均P＜0.05).LPS刺激2、4、8、24、36、48、54和72 h的各时点,siRNA病毒组巨噬细胞培养上清液TNF-α含量均明显低于Sramble病毒组(均P＜0.01).结论 针对NF-κB P65的siRNA可抑制NF-κB信号通路的功能活性,进而抑制内毒素刺激引起的巨噬细胞活化和TNF-α释放,提示RNA干扰技术在急性肺损伤早期过度炎症反应的防治中具有潜在应用价值.     

中性粒细胞活化和上皮细胞凋亡在急性肺损伤发生中的作用

致病因子一方面诱导肺泡巨噬细胞和上皮细胞产生多种细胞因子和趋化因子,激活中性粒细胞并使其向损伤部位聚集,从而产生炎症因子的瀑布式反应;另一方面激活死亡受体通路Fas-FasL等诱发肺上二皮细胞凋亡,从而引起肺组织损伤.另外,Fas活化后可通过介导肺内炎症介质释放和中性粒细胞聚集进一步加重肺损伤.中性粒细胞活化和上皮细胞凋亡在急性肺损伤的发生过程中起重要作用.     

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征与炎症因子关系的研究

急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS）是多种原发疾病过程中出现的急性进行性缺氧呼吸衰竭,是急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）的严重阶段,其特征性的病理学表现为肺实质炎症反应而导致的弥漫性肺泡上皮和肺微血管内皮的严重损伤,病死率高达40～60％。由于其发病机制错综复杂,迄今为止尚未完全阐明,这也是难以对ARDS进行有效的早期预防和治疗以降低死亡率的主要原因之一。本综述通过探讨各种促炎及抗炎因子与ALI／ARDS的关系,以期进一步探明其发病机制,并为临床更好的治疗ALI／ARDS提供更多依据。     

针对核因子-κB小干扰RNA防治脓毒症急性肺损伤的实验研究

目的:探讨针对核因子-κB(NF-κB)P65的小干扰RNA(siRNA)在脓毒症急性肺损伤防治中的保护作用。方法:将体质量18 g～20 g,雄性,昆明小鼠70只,随机分为健康组、脓毒症组、特异干扰组及乱序对照组,后3组均设置术后6 h、12 h 2个亚组(每组10只)。术前1 h特异干扰组尾静脉注射NF-κB P65 siRNA反转录病毒,乱序对照组注射scrambled siRNA反转录病毒,健康组及脓毒症组注射等量0.9%氯化钠液;分别对脓毒症组、特异干扰组及乱序对照组小鼠行盲肠结扎穿孔(CLP)手术构建急性肺损伤模型;术后6 h、12 h留取肺组织标本,观察肺病理改变;湿干质量比值(W/D);肺NF-κB染色强度;NF-κB mRNA、基质金属蛋白酶-9 mRNA(MMP-9 mRNA)及蛋白的活性水平。结果:采用CLP法成功构建小鼠急性肺损伤模型。与脓毒症组和乱序对照组比较,特异干扰组术后6 h、12 h肺组织较同时段脓毒症及乱序对照组肺组织病理损害及W/D值,NF-κB P65 mRNA,MMP-9 mRNA及蛋白活性减低,其中在6 h差异有统计学意义(P<0.05)。结论:针对NF-κB P65的siRNA抑制NF-κB的表达后,能够抑制脓毒症所致的早期的过度炎症反应,减轻急性肺损伤。     

NF-κBp65/IκBα在非小细胞肺癌组织中的表达

目的从蛋白和RNA水平研究NF-κBp65、IκBα在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达特点,探讨其在肺癌发生中的作用。方法免疫组化、Western blot方法检测NSCLC和癌旁肺组织中NF-κBp65和IκBα蛋白的表达,实时定量-PCR方法检测NF-κBp65和IκBα基因表达。结果共检测NSCLC组织62例(腺癌33例,鳞癌29例),癌旁肺组织27例。免疫组化显示NSCLC组织中NF-κBp65阳性表达率分别为58.6%和60.9%,显著高于癌旁肺组织(P均0.0001),而IκBα阳性表达率分别为12.3%和1.4%,显著低于癌旁肺组织(P均0.0001)。Western blot进一步证实:NF-κBp65蛋白在NSCLC组织中表达升高,IκBα蛋白表达降低。实时定量-PCR结果显示,NSCLC组织中NF-κBp65基因表达分别是癌旁肺组织的2.73±0.33倍和2.58±0.27倍(P=0.0046),而IκBα基因表达分别是癌旁肺组织的0.63±0.086倍和0.87±0.075倍(P=0.0208)。结论 NF-κBp65高表达和IκBα低表达可能在NSCLC发生过程中发挥重要作用。     

NF-κBp65 / IκBα 在非小细胞肺癌组织中的表达简

目的 从蛋白和RNA水平研究NF-κBp65、IκBα在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）组织中的表达特点,探讨其在肺癌发生中的作用.方法 免疫组化、Western blot方法检测NSCLC和癌旁肺组织中NF-κBp65和IκBα蛋白的表达,实时定量-PCR方法检测NF-κBp65和IκBα 基因表达.结果 共检测NSCLC组织62例（腺癌33例,鳞癌29例）,癌旁肺组织27例.免疫组化显示NSCLC组织中NF-κBp65阳性表达率分别为58.6%和60.9%,显著高于癌旁肺组织（P均〈0.0001）,而IκBα阳性表达率分别为12.3%和1.4%,显著低于癌旁肺组织（P均〈0.0001）.Western blot进一步证实：NF-κBp65蛋白在NSCLC组织中表达升高,IκBα蛋白表达降低.实时定量-PCR结果显示,NSCLC组织中NF-κBp65 基因表达分别是癌旁肺组织的2.73±0.33倍和2.58±0.27倍（P=0.0046）,而IκBα 基因表达分别是癌旁肺组织的0.63±0.086倍和0.87±0.075倍（P=0.0208）.结论 NF-κBp65高表达和IκBα低表达可能在NSCLC发生过程中发挥重要作用.     

靶向核转录因子-κB P65小干扰RNA对脓毒症所致小鼠急性肝损伤的影响

目的 探讨靶向核转录因子(NF)-κB P65 小干扰RNA(siRNA)对脓毒症所致小鼠急性肝损伤的保护作用.方法 将70只雄性昆明小鼠随机分为四组:即健康对照组、脓毒症组、特异干扰组和乱序对照组,后三组每组均设置术后6、12 h两个时间点,每组每个时间点10只小鼠;术前1 h特异干扰组尾静脉注射NF-κB P65 siRNA逆转录病毒,乱序对照组注射Scrambled siRNA逆转录病毒,健康对照组及脓毒症组分别注射等体积生理盐水;除健康对照组小鼠均行盲肠结扎穿孔(CLP)法构建脓毒症急性肝损伤模型;于术后6、12 h留取肝组织标本,检测组织病理学改变,NF-κB P65蛋白表达水平,TNF-α mRNA及蛋白的表达水平.结果.与脓毒症组和乱序对照组比较,特异干扰组术后6、12 h肝内NF-κB P65蛋白的表达均降低,肝脏病理损害均减轻;特异干扰组术后6 h肝内TNF-α mRNA及蛋白水平显著降低(P<0.05).结论.靶向NF-κB P65 siRNA抑制NF-κB的表达后,能够抑制脓毒症所致过度炎症反应,减轻急性肝损伤.