弹性蛋白及弹性蛋白降解产物在肝硬化患者中的表达特点

目的建立并优化竞争法酶联免疫吸附试验(ELISA)对弹性蛋白降解产物(EDP)的检测;观察弹性蛋白和EDP在肝硬化患者中的表达特点。方法回顾性纳入失代偿期肝硬化患者14例,健康对照人群10例,应用竞争法ELISA检测两组人群EDP表达水平,应用商品化ELISA试剂盒检测两组人群弹性蛋白水平。根据建立的剂量-反应曲线和曲线拟合的程度,选择最佳的竞争法ELISA检测EDP的条件。结果成功建立并优化竞争法ELISA检测EDP的条件,标准曲线呈线性拟合,R~2=0.99。通过对弹性蛋白和EDP的检测发现,肝硬化患者弹性蛋白的水平显著高于健康对照组[(32.19±12.17)ng/ml vs.(1.90±0.46)ng/ml,P0.05)],而EDP的表达显著低于健康对照组[(28.20±1.80)μg/ml vs.(60.80±1.46)μg/ml,P0.05]。结论弹性蛋白和EDP水平与失代偿期肝硬化相关。     

肝纤维化小鼠模型中弹性蛋白及其调控因子在肝纤维化形成和逆转中的分子机制

目的明确弹性蛋白在四氯化碳(CCl4)小鼠肝纤维化模型中的表达特点,初步探索弹性蛋白沉积的相关分子机制。方法建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化形成模型,通过Western Blot、可溶性蛋白及维多利亚蓝染色检测纤维化早期(CCl4注射4周)和进展期(CCl4注射8周)弹性蛋白的变化,同时以橄榄油做为健康对照组;其次,建立纤维化自发逆转模型,通过LC-MS/MS检测不同逆转时间(逆转0周、逆转4周、逆转8周、逆转12周)血清蛋白组学的变化,寻找潜在的与弹性蛋白沉积相关分子,并通过q PCR进行验证。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Tukey检验。结果弹性蛋白的相对表达量在早期纤维化组和进展期纤维化组分别为0. 82±0. 05、1. 59±0. 58,与健康对照组(1. 00±0. 11)相比,进展期纤维化组显著上升(P 0. 05)。对不可溶性弹性蛋白的检测发现,与健康对照组(207. 9±34. 7μg/10 mg)相比,早期纤维化组(213. 5±26. 7μg/10 mg)无明显变化(P0. 05),而进展期组显著升高[(352. 0±57. 0)μg/10 mg,P 0. 05]。肝组织弹性蛋白染色发现,与健康对照组(1. 03±0. 14)相比,弹性蛋白阳性面积早期纤维化组(2. 08±0. 16)和进展期纤维化组(4. 39±0. 51)均显著增加(P值均0. 05)。进一步检测了弹性蛋白酶12的基因表达,与健康对照组(1. 30±0. 10)相比,弹性蛋白酶12的基因水平随纤维化进展表达显著升高(早期纤维化:15. 50±2. 90;进展期纤维化:22. 70±4. 10,P值均0. 05)。利用LC-MS/MS分离并鉴定逆转过程中与肝纤维化进展和逆转相关的蛋白45种,其中与弹性蛋白沉积相关的蛋白包括赖氨酸氧化酶-1(LOXL-1)和Fibulin-1(FBLN-1)。通过q PCR对LOXL-1和FBLN-1基因验证证实,LOXL-1和FBLN-1的基因水平在CCl4注射8周(逆转0周)达到高峰,且随着逆转时间的延长表达逐渐下降。结论弹性蛋白沉积是进展期小鼠肝纤维化模型的重要特征之一,LOXL-1和FBLN-1介导的弹性蛋白沉积有可能成为肝纤维化特别是肝硬化和终末期肝病的治疗靶点。     

2015年欧洲肝病学会与拉丁美洲肝病学会无创检查评估肝脏疾病严重程度及预后临床指南要点

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TGFβ1诱导的肝脏前体细胞上皮-间质转换在逆转过程中可影响星状细胞活化

目的通过收集TGFβ1刺激过的前体细胞条件培养基,观察其对HSC的影响。方法收集TGFβ1预处理的前体细胞条件培养基,培养HSC细胞48 h,观察HSC活化程度及细胞外基质相关指标的变化。结果经TGFβ1刺激后的前体细胞形态明显变大变圆,胞质比例明显增加,核质比减少。去除TGFβ1刺激后,发现TGFβ1刺激超过24 h,前体细胞的上皮-间质转换发生逆转,表现为α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白表达量下降,24 h、36 h及48h分别为对照组的1.31倍(P0.05)、0.97倍(P=0.027)、1.08倍(P=0.058)。与对照组相比,TGFβ1刺激后前体细胞的条件培养基对HSCs的细胞形态无明显差别。进一步分析发现,TGFβ1刺激前体细胞6h后,其条件培养基促使星状细胞α-SMA及细胞外基质标志物金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1)在蛋白及基因水平上(分别为对照组的4.12倍及2.64倍)的表达;然而刺激超过24h上述作用相反,在蛋白水平表现为α-SMA表达降低而TIMP-1的表达无明显变化,在基因水平α-SMA及TIMP-1均呈降低趋势(24 h、36 h、48 h分别为对照组0.81倍及0.98倍、0.96倍及0.61倍、0.63倍及0.76倍)。结论去除TGFβ1的刺激后,其诱导的上皮-间质转换可发生逆转,并在逆转过程中可影响星状细胞的活化。     

肝硬化逆转的临床评价

目前大量临床研究已经证实,部分肝硬化可以实现逆转。因此,可准确评估肝硬化能否逆转以及何时逆转的方法成为临床研究焦点。这有助于更具有特异性地评估治疗效果,调整治疗方案以及判断预后结局等。从无创模型以及肝活组织检查等多方面,来探讨不同病因肝硬化逆转后各项指标的应用,旨在寻求更精准地反映逆转特征及手段。     

非酒精性脂肪性肝病动物模型的研究

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢性应激肝损伤,其病理主要表现为肝实质细胞脂肪堆积。截至目前,NAFLD的发病机制尚未完全阐明,临床上仍缺少行之有效的治疗方法。因此,建立能够准确模拟NAFLD疾病发生、发展过程的动物模型是探索NAFLD病因及筛选治疗靶点的重要基础。本文对目前常见的NAFLD饮食、化学和基因动物模型进行总结并系统地比较各自优缺点,以期为选择合适的动物模型用于NAFLD研究提供参考。     

动物模型在丙型肝炎研究中的应用与进展

丙型肝炎呈全球性流行,是引起终末期肝病的主要原因之一。建立理想的动物模型对研究丙型肝炎病毒（HCV ）相关肝病尤为重要。它不仅有利于丙型肝炎疫苗的研究,同时对深入研究丙型肝炎的慢性化致病机制,包括研究病毒变异特性与宿主免疫应答规律等,具有重要意义。但是,缺乏理想的动物模型阻碍了对 HCV的深入研究。     

大鼠肝脏前体细胞通过直接共培养抑制肝星状细胞的活化

目的：观察大鼠肝脏前体细胞系（WB-F344）对肝星状细胞系（HSC-T6）活化及细胞外基质的影响。方法将慢病毒-GFP 空白载体转染的 HSC-T6与 WB-F344按1∶1与1∶2比例直接共培养3 d,使用流式细胞仪对其进行分选,慢病毒-GFP 空白载体转染的 HSC-T6单独培养作为对照,观察 HSC-T6活化指标及细胞外基质相关指标表达的变化。结果经流式细胞仪检验慢病毒-GFP 空白载体转染 HSC-T6的效率可达近90％;与 WB-F344直接共培养3 d 后,HSC-T6的细胞形态与对照组相比无差别;同时利用 GFP 对各组 HSC-T6细胞分选后,经流式细胞仪检验纯度可达94％;对分选后的细胞进行分析发现,直接共培养组 HSC-T6细胞活化标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在基因水平（1∶1与1∶2组分别是对照组的0．66与0．61倍,P＜0．05）和蛋白水平（1∶1与1∶2组分别是对照组的0．61倍与0．25倍,P＜0．05）的表达均下降;HSC-T6细胞的细胞外基质标记物 I 型胶原（Col-I）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的表达与对照组比较差异无统计学意义。结论WB-F344细胞可以抑制 HSC-T6细胞的活化,但在一定时间内对其细胞外基质的表达没有影响。     

基于SHG/TPEF检测小鼠肝脏弹性纤维方法的建立

目的建立二次谐波与双光子激发荧光(SHG/TPEF)显微成像技术检测小鼠肝脏弹性纤维的方法。方法将8周龄雄性Col1α1-GFP转基因小鼠随机分为两组,每组5只,分别腹腔注射CCl4和橄榄油12周建立肝纤维化及对照小鼠模型。小鼠处死后获得肝组织并进行肝脏脱细胞处理,基于SHG/TPEF识别肝细胞外基质骨架结构中的胶原纤维和弹性纤维荧光信号。结果肝组织块脱细胞后骨架结构清晰可见,形态改变较小,弹性纤维伴随胶原纤维沉积,定位于汇管区和纤维间隔中;CCl4腹腔注射12周后,与对照组相比,肝组织胶原纤维面积百分比(12.4%vs.4.2%,P0.001)和弹性纤维面积百分比(2.8%vs.1.7%,P0.01)均显著升高。结论 SHG/TPEF可用于脱细胞后肝组织弹性纤维成像,较传统方法具有一定优势。