转染不同基因的NIT细胞体外抗细胞毒T细胞杀伤作用

目的　研究转染FADD缺失突变体(FADDdel)和WeelHu/GFP的胰岛β细胞株(NIT细胞)抵抗细胞毒T细胞的杀伤作用及其分泌胰岛素与细胞增殖所受的影响。方法　采用免疫磁珠法测量转染WeelHu基因的NIT细胞培养上清中的胰岛素水平及观察其增殖速度。将分别转染空载体pUC-pIC、pCMV和转染pFADDdel、pCMV-WeelHu、pCMV-WeelHu/GFP的NIT细胞与活化的淋巴细胞共培养,利用51Cr释放试验检测淋巴细胞对NIT细胞的杀伤作用。结果　转染WeelHu基因与未转染的NIT细胞胰岛素的分泌和生长速度没有明显变化(P>0.05)。转染pCMV-WeelHu/GFP或pCMV-WeelHu的NIT细胞其抗淋巴细胞杀伤能力明显高于转染空载体的NIT细胞(P<0.01),表达WeelHu或WeelHu/GFP融合蛋白的胰岛细胞之间抗凋亡能力差异无统计学意义,转染FADDdel在低剂量效靶比时对胰岛β细胞有一定保护作用(P <0.05),但在高剂量效靶比时与转染空载体比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论表达WeelHu或FADDdel的胰岛细胞可抵抗T细胞的杀伤,且对胰岛素的分泌及细胞增殖元明显影响。     

CTLA4Ig修饰的树突状细胞在体外对淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的:探讨CTLA4Ig修饰的树突状细胞(DC)对T细胞增殖和细胞毒性T细胞(CTL)细胞毒活性的影响。方法:采用脂质体转染法,将质粒pG/CTLA4Ig转入DC。采用ELISA和SDS-PAGE鉴定转染质粒pG/CTLA4Ig的DC培养上清。以C57BL/6小鼠的单个核细胞作为反应细胞,以未修饰的DC及修饰的DC作为刺激细胞,共培养6 d,用MTT比色法检测细胞的增殖。用乳酸脱氢酶法和ELISA法,分别测定细胞毒活性及T细胞凋亡。结果:CTLA4Ig融合蛋白和修饰的DC,对同种细胞刺激的增殖反应有明显地抑制作用;而未修饰的DC可显著诱导淋巴细胞增殖反应。CTLA4Ig融合蛋白和修饰的DC,对特异性CTL的细胞毒活性有明显地抑制作用,且可诱导T细胞凋亡。结论:稳定表达CTLA4Ig融合蛋白的DC,对T细胞增殖和对CTL的细胞毒活性具有明显地抑制作用,并可诱导T细胞凋亡。     

小鼠诱导性共刺激分子-Ig在小鼠树突状细胞中的表达及其效应研究

目的 获得mICOS-Ig基因修饰的小鼠DC，分析表达产物mICOS-Ig对T细胞活化的影响。方法 采用电转染方法将mICOS-Ig表达载体转入小鼠DC，通过ELISA法检测转染小鼠DC 60和96h以及稳定表达的培养上清；观察mICOS-Ig对同种混合细胞培养反应的影响。结果 ELISA法检测证明将mICOS-Ig表达载体转入小鼠DC，获得瞬时表达及稳定表达，mICOS-Ig可抑制单向混合淋巴细胞反应，抑制率达40％，其效应呈剂量依赖性。结论 获得了稳定表达mICOS-Ig融合蛋白的小鼠DC，mICOS-Ig表达产物对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用。     

小鼠PDL1-Red2融合蛋白真核表达载体的构建、表达及其效应

目的:小鼠跨膜型PD-L1与红色荧光蛋白(RFP)融合基因真核表达载体的构建、表达与鉴定, 及其效应初步研究.方法:应用基因工程技术构建重组载体, 脂质体转染NIT细胞株, 以流式细胞术(FCM)和倒置相差荧光显微镜检测融合蛋白的表达;采用混合淋巴细胞培养, 以FCM测定脾细胞的增殖反应.结果:融合基因在转染的真核细胞中获得表达, 并呈膜分布, 转染PD-L1/pDsRed2-N1的细胞对淋巴细胞增殖反应有一定的抑制作用, 表明PD-L1/pDsRed2-N1融合蛋白中分子标签未影响PD-L1的结构及其生物学活性.结论:PD-L1与DsRed2融合基因载体构建成功, 表达的融合蛋白具有生物学活性.     

可溶性mPDL1-hIgGFc表达载体构建、表达及对诱导细胞增殖与凋亡的影响

目的 可溶性mPDL1-hIgGFc(mouse PDL1-human IgG Fc)表达载体的构建与表达,及其对诱导细胞增殖与凋亡的研究.方法 以含有mPDL1基因的载体pmPDL1为模板,采用PCR的方法获得mPDL1胞外段基因,定向连接于含有hlgGFc基因片段的载体phIgGFc,构建表达载体pmPDL1-hIgGFc;采用脂质体将重组子转染CHO细胞,转染后的CHO命名为cHOp;ELISA和Western blot法检测目的 蛋白的表达,流式细胞术检测CHOp培养上清对混合淋巴细胞培养(MLC)的影响.结果 测序结果和酶切鉴定显示构建的表达载体pmPDL1-higGFc完全正确;ELISA和Westernblot法检测CHOp培养上清中有目的 蛋白表达;流式细胞术检测表明CHOp培养上清可体外抑制小鼠MLG,并诱导活化T细胞凋亡,其效应呈剂量依赖性.结论 成功构建mPDL1-hIgGFc表达载体;mPDL1-hIgGFc在体外可抑制MLC和诱导活化T细胞凋亡,具有负性调节T细胞的功能.     

hIL-10修饰树突状细胞对实验动物淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的：探讨hIL-10修饰DC对实验动物免疫功能的影响。方法：将经IL-10基因修饰或未修饰DC腹腔注射C57BL／6致敏小鼠，以致敏或未致敏C57BL／6单个核细胞作为反应细胞，以未修饰DC细胞及修饰DC为刺激细胞。共培养6天，MTT检测细胞增殖，乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性。结果：hIL-10对未修饰DC致敏或未致敏小鼠的同种细胞刺激的增殖反应有明显的抑制作用。hIL-10修饰DC诱导不同组小鼠淋巴细胞增殖反应显著低于未修饰DC细胞诱导小鼠淋巴细胞增殖反应，hIL-10修饰DC对不同组小鼠CTL细胞毒活性具有抵抗作用。结论：hIL-10修饰的DC诱导同种小鼠淋巴细胞的增殖反应显著降低和对CTL胞毒活性抵抗。     

可溶性人干细胞因子与EGFP融合基因的构建及真核表达

目的　可溶性人干细胞因子 (SCF)膜外活性区与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)融合基因表达载体的构建及其表达。方法　应用基因工程技术构建重组载体 ,电穿孔转染CHO K1细胞株 ,荧光分光光度计检测上清液中融合蛋白的表达 ,流式细胞仪检测其活性。结果　融合基因在瞬时转染的真核细胞中获得表达 ,并分泌至上清 ,且SCF EGFP融合蛋白中分子标签EGFP未影响可溶性人SCF膜外活性区的结构及其生物学活性。结论　可溶性人干细胞因子与EGFP融合基因载体构建成功 ,表达的融合蛋白具有生物活性 ,为进一步研究SCF对造血干细胞的生物学作用奠定了基础。     

Construction, Expression and In Vitro Biological Behaviors of Ig scFv Fragment in Patients with Chronic B Cell Leukemia

The clonotypic surface Ig receptor(SmIg)ex-pressed by malignant Bcells,idiotype,is a tumor-specific antigen and an attractive target for activei mmunotherapy.This kind of SmIg can be pro-cessed and presentedinthe context of MHCclass Iand classⅡmolecules onthe surface of the tumor.It has been shown that Id vaccination inducestumor-specific T cell responses in patients with Bcell malignancies.Such antigenic epitopes mayserve as candidates for novel peptide-vaccine strat-egies,and as tools …     

双顺反子载体pWISG的构建和共表达

肿瘤放、化疗对骨髓的抑制作用限制了其使用剂量,如何保护骨髓中的造血干细胞免受放化疗引起的杀伤和凋亡是研究热点之一。已知WEE1Hu可使细胞生长停滞于G2期检测点,以确保细胞在进入有丝分裂前完成DNA的复制和损伤修复[1],并且WEE1Hu可以抑制HIV、γ射线等诱导的细胞凋亡。人干细胞因子(hSCF)是一种重要的造血细胞生长因子,主要调控造血祖细胞的增殖、分化[2],并有一定的抗损伤作用。本实验采用核糖体插入位点(IRES)构建WEE1Hu、SCF/GFP双顺反子重组表达质粒pWISG,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来研究两者的共表达,为进一步功…