载脂蛋白CI的分子生物学研究进展

人、狒狒、大鼠、小鼠、狗和树载脂蛋白CI基因已克隆，人也含有无功能的载脂蛋白CI假基因，二者共同位于第19号染色体，并与载脂蛋白E、CII和CIV基因形成一个紧密的基因簇。载脂蛋白CI主要在肝脏表达，其特异性表达受基因的肝特异表达调控区及肝转录活性因子相互作用所决定。除在体外可激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶及抑制磷脂酶A2外，该蛋白对低密度脂蛋白受体亦有调节作用，从而影响血浆甘油三酯和胆固醇及相关脂蛋白的代谢。其多样的生物活性及其作用机制有待进一步研究。     

树鼩载脂蛋白CI蛋白质结构分析

为了获得树载脂蛋白CI的蛋白质结构信息，利用相应的计算机软件及改良的Chou等方法，对从构建的树肝组织cDNA文库中克隆出的载脂蛋白CIcDNA序列进行了分析和比较，并对编码的蛋白质氨基酸序列及其二级结构、亲疏水性进行了分析和预测。结果表明，克隆出的树载脂蛋白CIcDNA序列（新基因已被GenBank接受）由380个核苷酸构成，编码翻译88个氨基酸的载脂蛋白CI前体（含26个氨基酸构成的信号肽和62个氨基酸组成的成熟蛋白），并推测出该蛋白的功能域、蛋白质的二级结构及C末端有一明显的疏水区。结果提示：树载脂蛋白CI的疏水性及结合脂质的能力强于人的载脂蛋白CI。     

单克隆抗体双位点夹心ELISA测定人血清载脂蛋白E的研究

利用自制的抗人载脂蛋白E(apoE)单克隆抗体,建立了单克隆抗体双位点夹心ELISA测定apoE的方法,并对该方法的特异性、准确度、精密度和灵敏度进行了评价。载脂蛋白AⅠ、AⅡ、B、CⅠ、CⅡ、CⅢ不干扰测定,检测下限10ng,回收率101.2％,批内变异系数CV=5.9％,批间CV=8.1％。并测定了1048例正常人和各种疾病患者血清apoE含量。     

人载脂蛋白B基因3′端高可变区不同等位基因在真核细胞中对基因表达调控的作用

为探讨人载脂蛋白B基因3'端高可变区（hypervariableregion，HVR）不同等位基因对真核细胞基因表达调控的作用．选取在正常人群中分本最广的HVE36小等位基因和在冠心病病人中分布占优势的大等位基因HVE44，分别克隆进含荧光素酶基因的pGL2－promoter及pGL2－control质粒中，转染Hela细胞和HepG2细胞．结果发现，在不同的细胞系中插入HVE44等位基因的重组质位表达均高于插入HVE36的重组质粒的表达。表明载脂蛋白B基因3'端高可变区不同等位基因具有调控基因表达的作用，HVE44大等位基因可上调细胞内的基因表达，这或许是以HVE44等大等位基因为主体的动脉粥样硬化患者体内载脂蛋白B升高的原因之一．     

人载脂蛋白B基因3′端高可变区不同等位基因在真核细胞中对基因表达调控的作用

为探讨人载脂蛋白Ｂ基因３’端高可变区不同等位基因对真核细胞基因表达调控的作用。选取在正常人群中分布最广的ＨＶＥ３６小等位基因和在冠心病病人中分布占优势的大等位基因ＨＶＥ４４，分别克隆进含荧光毒酶基因的ｐＧＬ２－ｐｒｏｍｏｔｅｒ及ｐＧＬ２－ｃｏｍｔｒｏｌ质粒中，转杂Ｈｅｌａ细胞和ＨｅｐＧ２细胞。     

中国汉族和蒙古族人群载脂蛋白B基因3''端高可变区等位基因的分布频率及序列分析

载脂蛋白Ｂ基因３末端下游有一个高可变宫重复序列（ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｌｙｒｅｐｅａｔ，ＶＮＴＲ）也叫高可变区，每一个串连重复序列长度在１５ｂｐ左右，富含Ａ，Ｔ两相核苷酸，不同的串连重复序列拷贝数构成了等位基因的高度多态性，本文应用ＰＣＲ技术分析了汉族和蒙古族人群载脂蛋白Ｂ基因３ＶＮＴＲ等位基因的分布和频率；并测定了等位基因ＨＶＥ３４和ＨＶＥ４６的核苷酸序列，在汉族人群（１６     

载脂蛋白E基因多态性与高脂血症的相关性研究

选取１３３例高脂血症患者及１２２例正常对照人群，用多聚酶链反应方法快速鉴定其载脂蛋白Ｅ的基因型，结合血脂分析，研究载脂蛋白基因多态性与高脂血症的关系，结果表明，Ｅ３等位基因的分布频率在病例组中明显低于对照且，病例组中Ｅ４等位基因的分布频率明显高于对照组，表明Ｅ４等位基因与高脂血症显著相关。     

树鼩肝组织cDNA文库的快速构建

为了研究动脉粥样硬化不易感动物树多种载脂蛋白的基因分子结构,我们在国内外首次快速构建了树鼯肝组织ｃＤＮＡ文库。采用一步法提取树鼯肝组织总ＲＮＡ;以寡脱氧胸苷酸纤维素为吸咐介质,柱层析法进一步纯化ｍＲＮＡ。以此为模板。利用改良的ｃＤＮＡ快速合成方法,反转录合成树鼯肝组织ｃＤＮＡ第一、二链。对ｃＤＮＡ双裢末端修饰,连接含双酶切位点的连接子后重组于噬菌体载体,包装后获得２．１ｘ１０６高滴度的树肝组织ｃＤＮＡ文库,放射自显影显示合成的ｃＤＮＡ产物大小在４００－５０００个核苷酸之间,该文库的克隆重组率为９８．５％以上,扩增随机提取的白色噬菌斑ＤＮＡ,电泳鉴定均有ｃＤＮＡ插入片段。以制备的两种多价抗血清为探针,从构建的ｃＤＮＡ文库中筛选克隆出完整的树ａｐｏＡＩ和ａｐｏＣＩ的ｃＤＮＡ核苷酸序列。与常规方法比较,本法简便、快速、重复性好,易于操作和掌握,值得推广使用。     

高胆固醇血症低密度脂蛋白受体基因点突变的研究

目的：建立低密度脂蛋白－受体（ＬＤＬ－Ｒ）基因点突变监测方法,从基因水平对３０例原发性高胆固醇血症患者进行筛选、明确诊断。 方法：将聚合酶链式反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）与银染技术相结合,用１９对引物对ＬＤＬ－Ｒ基因的全部１８个外显子进行检测,３０例患者中,对筛查出的突变用ＰＣＲ产物直接测序或克隆测序的方法明确突变的性质和位置。 结果：确立的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ条件稳定,银染方法灵敏度高、重复性好,且避免了同位素污染。３０例患者中,发现１例定位于外显子１４的杂合子点突变患者,ＰＣＲ产物直接测序证实第６７１位密码子发生错义突变：ＣＣＣ→ＣＧＣ,导致脯氨酸→精氨酸;１例纯合子家族性高胆固醇血症患者外显子７发生点突变,克隆测序证实密码子３０８位发生错义突变：ＴＡＣ→ＴＧＣ,导致半胱氨酸→酪氨酸;２例杂合子患者外显子４的３’部分ＳＳＣＰ出现相同异常带型。查阅文献,测序证实的突变皆是新的突变。 结论：建立的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法可用于高胆固醇血症患者ＬＤＬＲ基因点突变的筛检。研究结果从基因水平证实中国家族性高胆固醇血症患者ＬＤＬ－Ｒ基因突变具有多样性的特点。