寨卡病毒包膜蛋白重组人腺病毒5型载体的构建与免疫原性测定

目的 以腺病毒5型载体（Ad5）构建含寨卡病毒（ZIKV）包膜蛋白（prM-E）的复制缺陷型5型重组腺病毒（rAd5）表达载体,测定prM-E在细胞中的表达及对小鼠的免疫原性。方法 从ZIKV毒株Z16006（亚洲型）分离获得prM-E基因片段,以重组腺病毒AdMax^TM系统包装重组腺病毒rAd5/prM-E。选用C57BL/6小鼠,以rAd5/prM-E 10⁷、10⁸和10⁹ PFU三个剂量肌内注射免疫小鼠,在第3周同等剂量加强免疫一次,第5周从小鼠眼球取血并分离脾淋巴细胞。分别以ELISpot和ELISA方法测定小鼠对ZIKV prM-E的体液与细胞免疫反应。结果 成功构建复制缺陷型重组腺病毒载体rAd5/prM-E,采用Western blot方法和抗ZIKV E抗体检测rAd5/prM-E感染的293A细胞表达产物,可见与E蛋白相应的56 kDa蛋白带。以ELISpot方法测定小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ分泌细胞形成斑点数（SFCs）,结果分别为（688.54±186.43）、（1 084.90±144.14）和（1 640.20±147.13） SFCs/10⁶脾细胞,与病毒接种剂量呈正比关系;采用ELISA测定免疫小鼠血清中抗E抗体,其滴度（log10值）分别为（3.14±0.39）、（3.50±0.30）和（3.74±0.25）, 均高于对照组小鼠（0.80±0.17）,差异具有统计学意义（P<0.001）。结论 rAd5/prM-E具有感染小鼠并诱导小鼠产生强烈的特异性抗体和细胞免疫反应的能力,表明prM-E具有良好的免疫原性,为ZIKV候选疫苗研制提供了可靠的免疫源。     

抗补体——ELISA及其在动物传染病诊断中的应用

免疫酶标技术的应用提高了动物传染病的血清学诊断水平,但检测不同种动物抗体时,均需有各自种特异性的酶标第二抗体系统,给实际工作带来诸多不便。因此,寻觅一种广谱的标记系统甚为必要。本研究将补体结合反应的基本原理与ELIsA法相结合,以酶标抗补体作为广谱标记系统,建立了抗补体—ELISA工作程序,并检测了多个类别的血清,取得了满意结     

重组人αD型干扰素的纯化研究

αD型干扰素(IFN αD,亦称白细胞干扰素)具有广谱的抗病毒、抑制肿瘤细胞及免疫调节等多种重要的生物活性。现行的IFN αD纯化工艺存在着纯化效率低、时间长、影响因素多等不足。本研究建立了新的纯化工艺流程。该工艺将制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放在了阴离子纤维素层析之前,并省略了阳离子纤维素层析的步骤。这种改进的主要优点是提高了IFN     

羊布鲁杆菌M5-90 BP26抗原单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5-90 BP26抗原单克隆抗体,并对抗体进行鉴定.方法 将质粒pET-28a-BP26转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21 (DE3),构建原核表达质粒pET-28a-BP26,用镍离子金属螯合亲和层析法(Ni-NTA)纯化、重组BP26蛋白(rBP26).将纯化后的rBP26蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合成乳化抗原,接每只100 μg/0.1 ml在BALB/c小鼠皮下多点注射进行初次免疫;2周后,按每只50μg/0.1ml 在小鼠皮下多点注射进行再次免疫.再次免疫后2周,小鼠尾静脉取血测效价,检测免疫效果;在细胞融合前3天,将乳化抗原按每只小鼠50μg腹腔注射加强免疫.将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞按1∶5比例在聚乙二醇( PEG) 1450作用下进行细胞融合,置于37℃、5％CO2培养箱中培养;10 d后取细胞培养上清液,用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定,筛选分泌抗rBP26抗体的杂交瘤细胞;再经过反复3次克隆,筛选出单克隆全阳性的杂交瘤细胞建株,用杂交瘤细胞株制备BP26抗原单克隆抗体,并以初始杂交瘤细胞克隆导命名.利用羊布鲁杆菌M5 -90疫苗株制备膜蛋白提取物(NMP),采用免疫印迹法(Western)及斑点间接酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)对筛选的单克隆抗体进行免疫学特性鉴定,用单克隆抗体亚型试剂盒进行抗体分型和Kappa (κ)和Lambda(λ)轻链鉴定.结果 成功地获得2株能稳定分泌抗rBP26抗原的高亲和性杂交瘤3C3和5A5单克隆抗体,并能与羊布鲁杆菌M5-90疫苗株上的NMP结合,构建成M5-90 BP26抗原单克隆抗体,抗体亚型分别为IgG1和IgG2b,轻链均为κ链.结论 鉴定结果表明,成功制备2株羊布鲁杆菌BP26抗原的高亲和性单克隆抗体,抗体具有识别M5-90疫苗株的膜蛋白构象表位的能力,优势表位的识别可为羊布鲁杆菌M5-90疫苗株的改造提供实验依据.     

登革1型病毒荧光定量PCR快速检测

目的建立登革1型病毒的快速特异的荧光定量PCR检测方法。方法设计登革1型病毒特异的引物和TaqMan探针,制作标准曲线,并检测其特异性、重复性、再现性和敏感性,采用荧光定量PCR和常规PCR对临床标本进行检测比较。结果成功构建了标准曲线,回归方程为Y=-3.410logX+45.10,相关系数R2=0.999,扩增效率Eff=96.5%,灵敏度可达103 copies/mL,此荧光定量PCR方法对登革1型病毒检测高度特异,与其他3型登革病毒和乙型脑炎病毒之间并无交叉反应;采用登革病毒种特异引物探针和本研究建立的登革1型病毒型特异引物探针对166份cDNA样本进行荧光定量PCR检测,均发现126份为阳性,阳性率均为75.9%,Ct值为20.84～36.36,浓度范围为1～1.3×104copy/μL;常规PCR方法检测到其中36份为阳性,阳性率为21.7%。结论荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测登革1型病毒,并能实现对病毒滴度的绝对定量。     

人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。     

预防医学生亟需开展《实验室生物安全》教育

美国“9．11”事件前，生物安全这一名词还不为公众所熟悉。关注的人仅局限在专家范围内。“9．11”事件后，尤其是“炭疽粉末邮件事件”发生后，生物安全已从“知之者甚少”转为“知之者甚众”。2002年岁末，SAILS的暴发流行使生物安全成为国内民众街谈巷议的重要话题。2004年北京发生的SAILS冠状病毒实验室感染事件更使普通老百姓对这一问题的关注达到空前的地步。     

基于二代测序的RhD阳性个体RHD基因mRNA选择性剪接分析

本研究旨在对RhD阳性个体中红细胞特异性表达的RHD基因不同转录本进行分析,并对选择性剪接发生的机制进行初步探讨。     

一种可用于多DNA片段连接的新SOE-PCR方法

目的 通过对重叠延伸PCR技术的改进,建立一种可用于多DNA片段连接的SOE-PCR方法 .方法 扩增获得相互重叠的1.8、1.1、1.3 kb的短片段,以之作为亚片段模板.在SOE-PCR反应体系中加入不同数量用于重叠的亚片段模板及延伸所得目的 长片段扩增所需的外引物,同时加入了稀释100倍的内引物,使得亚片段模板在扩增过程中能动态达到最佳重叠延伸浓度.结果 获得了特异性强、丰度高的两段连接产物,与原有的SOE-PCR方法相比,大大减小了反应的非特异性条带扩增,产物丰度也优于传统的扩增方法 .采用同样方法尝试了单管反应对三个片段进行连接,获得了总长度为4.2 kb的长片段,且实验重复性、特异性好.结论 本研究以相互重叠的多个短片段为模板,实现多片段的连接和扩增,可降低受模板浓度条件的影响的实验操作难度.多片段连接时减少了操作步骤和突变几率,可广泛用于多DNA片段连接操作.     

肇庆市互助献血与自愿无偿献血情况对比分析

目的通过肇庆市互助献血者与自愿无偿献血者的情况对比,分析互助献血在现阶段献血招募工作中的价值。方法依据2006-2012年肇庆市《全血献血登记表》和《单采血小板献血登记表》中登记的内容,用广东迈科网络血站信息系统,统计分析互助献血者和自愿无偿献血者年龄、人数、性别、献血频次、季节性分布、传染性指标检测结果,比较互助献血者与自愿无偿献血者献血的情况。结果 2006-2012年互助献血的人数呈逐步上升趋势,互助献血1 834人次,占总献血人次的0.84%,其中互助捐献单采血小板共计372人次,占总捐献单采血小板人次的5.37%。互助献血者和自愿无偿献血者的性别、文化程度、献血频次、月份、传染病指标结果比较差异均有统计学意义(P0.05),而年龄差异无统计学意义(P0.05)。结论互助献血在现阶段可作为自愿无偿献血的有益补充。