血管紧张素Ⅱ促进培养的新生鼠心肌细胞表达TNF-α

目的观察血管紧张素Ⅱ对培养心肌细胞表达TNF-α的影响.方法采用新生大鼠心肌原代培养和免疫组化,RT-PCR评价用10-7 M血管紧张素Ⅱ,100 ng/ml脂多糖(LPS)对心肌细胞表达TNF-α的影响.结果 TNF-α的免疫组化染色在对照心肌细胞呈阴性,100 ng/ml脂多糖和10-7M血管紧张素Ⅱ作用心肌细胞24小时、48小时后,心肌细胞胞浆中出现棕色颗粒,随着作用时间的延长有增强趋势.与单纯培养的对照心肌细胞相比,10-7M血管紧张素Ⅱ,100 ng/ml 脂多糖刺激心肌细胞24小时后心肌细胞TNF-α表达的mRNA显著增高,刺激48小时,TNF-α mRNA进一步增高.结论正常情况下培养的新生大鼠心肌细胞表达的TNF-α在蛋白质水平和mRNA水平均极低,10-7M血管紧张素Ⅱ可以促使培养的心肌细胞表达TNF-α,提示它可能是血管紧张素Ⅱ对心肌的效应机制之一.     

溶血磷脂酸受体与大鼠急性心肌梗死后早期心肌细胞凋亡的关系

目的：本研究以急性心肌梗死为心肌损伤的诱发因素,检测急性心肌梗死后早期（48 h）大鼠溶血磷脂酸3种不同受体亚型表达谱,分析其与心脏细胞的病理学特征及心功能的关系.方法：[1]冠状动脉结扎术后24 h存活的16只雌性SD大鼠作为心肌梗死组,另设假手术组为对照组.[2]术后48 h行血流动力学测定、称重及病理切片分析心肌肥厚状况;原位末端标记法和DNA凝胶电泳检测心肌细胞凋亡.[3]反转录聚合酶链反应方法检测溶血磷脂酸3种受体亚型基因表达谱.结果：[1]与假手术组相比,心肌梗死组左心室收缩压和左心室内压最大上升下降速率均显著降低（P＜0.05～0.01）,左心室舒张末压显著升高（P＜0.05）.[2]病理切片分析心肌梗死后48 h,无明显的左室扩张与心肌肥大.[3]DNA凝胶电泳与原位末端标记法的结果显示大鼠急性心肌梗死后心肌细胞凋亡指数显著升高[梗死区与梗死边缘区凋亡指数分别为（21.286&;#177;15575）%,（19.816&;#177;12.000）%,假手术组（1.270&;#177;1.070）%,P＜0.01].[4]反转录聚合酶链反应结果显示,与假手术组相比,心肌梗死后早期重塑过程中溶血磷脂酸1、溶血磷脂酸2受体基因表达无显著差异,而溶血磷脂酸3受体表达增加40%（P＜0.01）.结论：大鼠急性心肌梗死后早期出现左心室功能异常,早期重塑过程中（术后48 h）有大量心肌细胞凋亡,但无明显的左室扩张与心室壁肥厚,而同时溶血磷脂酸3受体表达显著增加,提示溶血磷脂酸3与心肌梗死后心肌细胞凋亡相关,可能主要介导溶血磷脂酸在心肌梗死后早期的凋亡通路的调节.     

常规TRIzol法提取血清microRNA的改良

目的:对现有常规提取血清microRNA的方法进行改良。方法:运用常规TRIzol法和改良后的血清microRNA提取方法分别提取健康人血清中的microRNA;利用反转录茎环引物及TaqMan探针进行实时荧光定量PCR检测miR-16和miR-21的含量,通过比较miR-16和miR-21的Ct值以鉴定不同提取方法对microRNA检测的影响。结果:改良后的血清microRNA提取方法可明显降低PCR检测中miR-16和miR-21的Ct值。结论:改良的血清microRNA提取方法可有效提高目的microRNA的检出水平。     

溶血磷脂酸受体基因在大鼠心肌细胞的表达分析及3型受体亚型的克隆鉴定

目的确定5种亚型溶血磷脂酸受体（LPAR）基因在大鼠心肌细胞中的表达,针对主要分布亚型LPAR3基因构建重组质粒。方法利用实时荧光定量PCR和Western Blot检测LPA受体亚型在原代培养乳鼠心肌细胞的表达量;克隆LPAR3基因的编码区全序列,构建重组质粒。结果在5种LPAR亚型中,LPAR3在心肌细胞中的表达最高,其次为LPAR1,LPAR4和LPAR5在心肌细胞中的表达较低,而LPAR2则未检测到;Western Blot检测显示LPAR3的表达明显高于LPAR1的表达。对LPAR3基因进行序列分析,结果显示GenBank中序列号为NM_023969.1的序列与其它物种的该序列比较,缺失了一段保守的碱基片段;根据另一条序列（AB051164.1）设计引物,成功扩增LPAR3全基因片段,构建重组质粒。结论 LPAR3是大鼠心肌细胞中主要的溶血磷脂受体亚型;GenBank中序列号为NM_023969.1的LPAR3基因序列存在碱基缺失,大鼠中编码LPAR3的正确序列为AB051164.1。     

大鼠骨髓间充质干细胞条件培养液对心脏成纤维细胞胶原合成的影响

目的体外模拟机体缺血环境,研究骨髓间充质干细胞(MSCs)旁分泌对心脏成纤维细胞胶原合成的影响,为MSCs移植机制提供实验依据。方法分离培养SD大鼠的MSCs,换以无血清培养液同时缺氧处理不同时间,然后收集MSCs的条件培养液,以此条件培养液作为刺激因子孵育 SD大鼠的心脏成纤维细胞,用MTT和3H-脯氨酸掺入观察心脏成纤维细胞的增殖及胶原合成。结果用MSCs条件培养液培养心脏成纤维细胞,3H-脯氨酸掺入明显高于对照组,缺氧6 h组的3H-脯氨酸掺入高于对照组约100％,提示MSCs条件培养液刺激心脏成纤维细胞胶原合成增加;MTT结果无显著差异,提示:MSCs条件培养液没有影响心脏成纤维细胞的增殖。结论大鼠骨髓间充质干细胞的缺氧和无血清条件培养液能够通过旁分泌刺激心脏成纤维细胞自身合成胶原能力的增强,提示移植到缺血心肌缺血区的骨髓间充质干细胞可能通过旁分泌作用影响心脏成纤维细胞的胶原合成,从而参与损伤心肌的修复。     

溶血磷脂酸对幼年大鼠心肌细胞收缩和钙瞬变的影响

目的我们前期的研究发现LPA受体在幼年大鼠心脏的表达显著高于成年的表达,提示LPA信号在心脏收缩功能尚未成熟时可能具有更为重要的调节作用。本研究通过观察LPA对此未成熟阶段心肌细胞钙瞬变和收缩力的作用,探讨LPA信号对幼年心肌兴奋-收缩耦联的影响。方法 Langendorff装置逆向灌流胶原酶分离获得不同发育阶段大鼠心肌细胞;采用IonOptix细胞收缩和钙离子浓度同步测定系统进行心肌细胞收缩力和钙瞬变的测定;Western blot检测不同发育阶段心肌细胞LPA受体的表达。结果 LPA对出生后14天和21天大鼠心肌细胞的收缩和钙瞬变均没有显著影响,表明LPA信号并不参与出生后14-21天大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联过程和心肌细胞收缩。在大鼠出生后发育过程中,LPA受体在心肌细胞的表达在出生后14天已显著下调,不同于在整体心脏表达下调的时间点(P21d),这可能是LPA对此发育阶段心肌细胞的收缩和钙瞬变均不产生影响的原因,提示在出生后14天LPA信号对心肌细胞的发育调节功能可能即已减弱或消失。结论 LPA信号对出生后14天及之后心肌收缩和钙瞬变无显著影响,但尚不能排除LPA对出生后更早期的未成熟心肌细胞收缩和兴奋-收缩耦联的作用。     

溶血磷脂酸及其受体在大鼠心肌重塑中的作用

目的研究溶血磷脂酸（LPA）及其受体对心脏成纤维细胞增殖的影响及与心肌重塑的关系，探索LPA在心脏组织的生物学作用。方法采用^3H-TdR或^3H-Leu掺入法测定LPA对心脏成纤维细胞DNA及蛋白质合成的影响；用Northern杂交检测c-FOS mRNA的表达；RT-PCR测定大鼠急性心梗心肌组织LPA受体基因表达。结果LPA以浓度依赖方式刺激乳鼠心脏成纤维细胞DNA合成和蛋白质合成；LPA刺激成纤维细胞c-FOS mRNA表达呈时间与剂量依赖性；G-蛋白偶联受体阻断剂苏拉明（suramin）能有效抑制LPA诱导的成纤维细胞DNA合成及c-FOSmRNA表达上调。大鼠急性心梗5周后，心肌梗死区LPA受体mRNA表达上调。结论LPA通过G-蛋白偶联受体诱导c-FOS基因表达增加，从而刺激心脏成纤维细胞增殖，参与急性心梗后心肌重塑的形成和发展。LPA在心脏组织中有重要的生物学功能。     

溶血磷脂酸受体与大鼠急性心肌梗死后早期心肌细胞凋亡的关系

目的本研究以急性心肌梗死为心肌损伤的诱发因素,检测急性心肌梗死后早期(48 h)大鼠溶血磷脂酸3种不同受体亚型表达谱,分析其与心脏细胞的病理学特征及心功能的关系.方法[1]冠状动脉结扎术后24 h存活的16只雌性SD大鼠作为心肌梗死组,另设假手术组为对照组.[2]术后48 h行血流动力学测定、称重及病理切片分析心肌肥厚状况;原位末端标记法和DNA凝胶电泳检测心肌细胞凋亡.[3]反转录聚合酶链反应方法检测溶血磷脂酸3种受体亚型基因表达谱.结果[1]与假手术组相比,心肌梗死组左心室收缩压和左心室内压最大上升下降速率均显著降低(P＜0.05～0.01),左心室舒张末压显著升高(P＜0.05).[2]病理切片分析心肌梗死后48 h,无明显的左室扩张与心肌肥大.[3]DNA凝胶电泳与原位末端标记法的结果显示大鼠急性心肌梗死后心肌细胞凋亡指数显著升高[梗死区与梗死边缘区凋亡指数分别为(21.286±15575)%,(19.816±12.000)%,假手术组(1.270±1.070)%,P＜0.01].[4]反转录聚合酶链反应结果显示,与假手术组相比,心肌梗死后早期重塑过程中溶血磷脂酸1、溶血磷脂酸2受体基因表达无显著差异,而溶血磷脂酸3受体表达增加40%(P＜0.01).结论大鼠急性心肌梗死后早期出现左心室功能异常,早期重塑过程中(术后48 h)有大量心肌细胞凋亡,但无明显的左室扩张与心室壁肥厚,而同时溶血磷脂酸3受体表达显著增加,提示溶血磷脂酸3与心肌梗死后心肌细胞凋亡相关,可能主要介导溶血磷脂酸在心肌梗死后早期的凋亡通路的调节.     

心肌胶原及代谢

1981年,Borg和Caulfield应用扫描电镜对心脏间质进行系统研究,提出心脏纤维胶原网络的新概念。胶原网在心肌中有重要作用,它将心肌细胞和血管固定,相互连接呈一体,直接影响它们的收缩、舒张和在完整组织中的形态,而胶原在这个网络中占有举足轻重的作用,心肌纤维化的形成是胶原合成与分解代谢失衡的结果。     

常规TRIzol法提取血清microRNA的改良

目的:对现有常规提取血清microRNA的方法进行改良.方法:运用常规TRIzol法和改良后的血清microRNA提取方法分别提取健康人血清中的microRNA;利用反转录茎环引物及TaqMan探针进行实时荧光定量PCR检测miR-16和miR-21的含量,通过比较miR-16和miR-21的Ct值以鉴定不同提取方法对microRNA检测的影响.结果:改良后的血清microRNA提取方法可明显降低PCR检测中miR-16和miR-21的Ct值.结论:改良的血清microRNA提取方法可有效提高目的microRNA的检出水平.